[发明专利]一种头孢菌素类化合物生产菌株及其应用

说明书

本发明提供了一种生产头孢菌素类化合物的菌株及其制备方法，还提供了该菌株发酵生产的DAOC并进一步制备7‑ADCA的方法，通过该菌株发酵生产的DAOC产量高、色纯高，质量优异，有利于进一步制备生产7‑ADCA，为7‑ADCA环保、稳定的工业化生产提供了新手段。

技术领域

本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种头孢菌素类化合物生产菌株及其应用。

背景技术

头孢菌素是一类具有重要治疗意义的抗生素，属β-内酰胺类抗生素家族成员，目前占我国抗生素药物市场份额高达51％。工业上用顶头孢霉菌发酵制备或者将青霉素的四氢噻唑环化学扩环形成双氢噻嗪环制备。在β-内酰胺和双氢噻嗪环的各个位置插上侧链可以合成大量具有更强抗生能力或药物动力学性质改善的头孢菌素。近年来，对于制备这类半合成抗生素已经表现出越来越浓厚的兴趣，并在它们的制备工艺和方法上产生了许多优化和创新。

7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)是制头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定等半合成头孢菌素的重要中间体，与7-氨基头孢烷酸(7-ACA)相比，在3位消除了不稳定的乙酰氧基，具有广泛的应用前景。目前7-ADCA的合成主要是化学合成法，由价廉易得的青霉素G(或V)经酯化、扩环重排、酶解去侧链而得。其反应过程包括青霉素G在低温下经过氧乙酸氧化后用双-三甲基硅脲进行酯化保护；吡啶和溴乙酰作用下加热进行开环、脱水、分子重排产生6-元的头孢菌素环结构；水解去三甲基硅后酰化酶水解脱侧链得到7-ADCA。然而，化学合成不可避免地存在化学溶剂的毒性和污染的问题。

专利US5354667、EP0496993、EP0843015等都公开了在DAO和GLA酶的催化下，将乙酰氧头孢菌素C(DAOC)转化成7-ADCA的方法，但均没有用于工业生产中。DAOC可以从头孢菌素C(CPC)发酵过程中获得，然而，CPC发酵过程的产物中还包括有CPC、去乙酰头孢菌素C(DCPC)等物质，DAOC是CPC发酵过程中的副产物，CPC的结构类似物，因此在发酵中无法得到单纯的DAOC产物。公开号为CN1357051A的专利，公开了一种将A.chrysogenum菌株的cefEF基因失活，表达cefE基因得到的新菌株，能使DAOC的产量提高，而DAOC是主要的头孢菌素。但是，通过基因工程的方法改造菌株具有很大的不稳定性。

利用微生物发酵的方法获得产量高、纯度高的DAOC，将为7-ADCA的合成提供重要的新途径。微生物的诱变筛选是获得高产高效的优良工业菌株的重要手段，但是目前，还未有通过诱变方法得到产量高、色纯高的产DAOC菌株的方法报道。

发明内容

本发明菌株通过诱变选育得到产DAOC的菌株，通过酶法将DAOC侧链切除后由DAOC制备7-ADCA，减少了化学合成法中的化学溶剂有毒性和污染问题，同时解决了基因工程方法改造菌株不稳定的问题，具有非常重大的工业生产价值。

本发明目的是提供一种头孢菌素类化合物生产菌株及其应用。

同时本发明要解决的技术问题之一在于提供一种顶头孢霉菌(Cephalosporiumacremonium)及其诱变选育方法，使其发酵产物DAOC大幅度提高。

本发明要解决的技术问题之二在于提供所述顶头孢霉菌发酵产DAOC进一步合成7-ADCA的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种头孢菌素类化合物生产菌株，其为顶头孢霉菌(Cephalosporiumacremonium)B-1822-S-04的突变体菌株，名称为D-G3-B-2001，已于2020年9月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏编号为CGMCC NO:20270。

本发明所述的顶头孢霉菌D-G3-B-2001的筛选方法是：顶头孢霉菌B-1822-S-04出发菌株，通过化学和物理相结合的复合诱变的方法使其突变，诱变通过摇瓶进行反复筛选，直至筛选到目标菌株，即顶头孢霉菌D-G3-B-2001。