[发明专利]一种基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽及其应用

说明书

本发明公开了一种基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽及其应用，该细胞穿膜肽由22个氨基酸组成，其氨基酸序列为：YGRKKRRQRRRHLFYWKLRFCF。本发明首次发现源于NMDA 2A受体第三跨膜区域C端一段多肽序列设计的细胞穿膜肽2A‑CPP。该多肽在低浓度下具有较好的细胞膜穿透能力，又因具有2A受体的特异靶向性，干扰NMDA受体内化，抑制ERK磷酸化，故可携带蛋白质等生物分子跨膜进入体外多种细胞(包括贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、原代培养细胞及传代培养细胞等)内，是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体。而在高浓度下，又可产生细胞破膜作用，血循环半衰期大于6h，能保持较好的细胞形态，保证细胞表面抗原被充分检测。

技术领域

本发明属于生物医疗领域，具体是指一种基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽2A-CPP及其应用。

背景技术

磷脂双分子层结构的细胞膜对维持细胞的结构和功能起着非常重要的作用，选择性地让一些小分子物质进出细胞，而一些外源性物质尤其是亲水性大分子物质则不能够通过细胞膜进入细胞内部，这对运载一些诊断和治疗潜力生物活性分子、药物进入细胞内构成了障碍。细胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPPs)的一个重要特点是可以携带多种不同大小和性质的生物活性物质进入细胞，包括小分子化合物、染料、多肽、多肽核酸(peptide nucleo acid,PNA)、蛋白质、质粒DNA、siRNA、200nm的脂质体、噬菌体颗粒和超顺磁性粒子等，这一性质为其成为靶向药物的良好载体提供了可能。CPPs作为载体的优势在于低毒性和无细胞类型的限制，尽管CPPs可输送不同类型的物质进入细胞，但其实际应用多集中于寡肽、蛋白质、寡聚核苷(oligonucleotides，ONs)或类似物的细胞转运。因此，如何引导这些物质穿透细胞膜是一个迫切需要解决的问题。

目前介导生物大分子穿透细胞膜的方法主要包括细胞穿膜肽、脂质体、腺病毒、纳米颗粒、影细胞等，而细胞穿膜肽是一类以非受体依赖方式，非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽，它们的长度一般不超过30个氨基酸且富含碱性氨基酸，氨基酸序列通常带正电荷。人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV-1)的反式转录激活因子(Tramactivating transcriptional activator,TAT)是第一个被发现的细胞穿透肽，它凭借一种无毒的、高效的方式进入细胞。此外，如果蝇艇角同源异形域(antennapedia homodomain,ANTP)、单纯疱疹病毒I型VP22转录因子、多聚精氨酸(Rn)等蛋白结构域，也具有介导异源蛋白、寡聚核苷酸、脂质体等大分子直接透过细胞膜进入细胞的功能。

一般来说，细胞穿膜肽可通过以下三种方式进入细胞：第一是直接穿膜进入细胞，此种方式是非能量和温度依赖性的，Veach等研究发现TAT蛋白在4℃和37℃具有同样的内化效率，并且在ATP删除的细胞中，内化过程仍没有被阻止；第二种是胞吞介导的移位作用，这种机制不同于直接转运，它是一种能量依赖的转运方式，这种传导机制又可以进一步分为两大类：吞噬作用和胞饮作用。吞噬作用主要发生于结构较大的颗粒货物的吸收，胞饮作用主要出现于对可溶解性货物的吸收。胞饮作用发生于各种类型的细胞中。已被报道的CPPs所用的胞饮方式有巨胞饮、网格蛋白依赖途径、胆固醇依赖网格蛋白介导途径和小窝蛋白/网格蛋白非依赖型途径等；第三种是通过形成某种跨膜结构发生的转导模式，这种机制的穿膜机理是通过反相胶束结构形成，与疏水性膜结合，然后进入细胞内。为什么同样的CPPs却存在不同的穿膜机制和通路，究其原因主要是其穿膜机制会受到诸多因素的影响，如所携带“货物”分子的大小、理化特性的不同、穿膜目标细胞的不同、CPPs的使用浓度和实验操作条件等。因CPPs的理化特性和穿膜机制不同，所以不同的CPPs在不同领域(肿瘤治疗、抗炎、生物成像、核酸与蛋白质的传送)的应用各有其倾向性。