[发明专利]一种去单核体外培养NK细胞的方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种去单核体外培养NK细胞的方法。一种去单核体外培养NK细胞的方法，包括以下步骤：(1)分离血清和全血细胞；(2)灭活血清；(3)获取单个核细胞；(4)贴壁培养单个核细胞；(5)激活单个核细胞；(6)诱导NK细胞；(7)扩增NK细胞。本发明不需要包被，操作简单，经过激活培养基培养和增殖培养基使得NK细胞能够优势生长，经过10‑20d的培养，扩增倍数可达1000‑1300倍，经流式细胞仪检测，CD3‑C56+所含的比例在80‑98％之间，有利于产业化生产。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种去单核体外培养NK细胞的方法。

背景技术

肿瘤作为重大疾病一直困扰人类的健康。随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但目前仍然由于肿瘤的复杂性、多样性、可变性和异质性，找不到一种更好的治疗方法。目前医疗行业内对癌症的治疗方法有手术切除、化学疗法及放射线疗法，但对人体的损伤较大。而过继性免疫疗法引起靶向性突出、副反应较少、干预方式简单等优点成为当今用于研究肿瘤治疗的热点，而且在临床得到广泛的应用。

NK细胞因其无MHC限制、肿瘤杀伤范围广、免疫响应速度快而成为过继性免疫疗法的突出细胞之一。NK细胞又称自然杀伤细胞，NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群，是人体免疫细胞中的一种淋巴细胞，是先天免疫细胞的关键部分，被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。

近年来，NK细胞抗肿瘤已经在美国和日本等国家进行了大量的临床试验，显示了良好的应用前景。据国内外相关报道，体外扩增NK细胞的技术主要有三种：一是磁珠分选法，从单个核细胞得到纯化的NK细胞，体外扩增；二是利用饲养层细胞培养NK细胞；三是直接利用因子刺激从外周血中扩增培养NK细胞。前两种扩增NK细胞的方法在临床上应用的安全性尚未得到验证，且磁珠分选法成本价高、饲养层细胞用为肿瘤细胞存在一定的风险，因此这两种方法多用于科研研究；第三种利用细胞因子刺激扩增培养NK细胞的方法安全性较好，临床应用价值高。而传统的因子激活是单方面的激活NK细胞，使其种群优势进而获得高浓度的NK细胞，但当初始NK浓度较低时其种群优势无法压制T细胞、单核细胞等其他细胞的增殖，进而得不到纯度较高的NK细胞，对于不同初始浓度NK的样本进行培养其结果是不稳定的。因此，寻找一种稳定性高，成本低、无外源血清、无饲养层细胞、无需包被、操作简单且扩增倍数高的NK细胞体外培养方法是很有必要的。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明目的在于为了克服目前NK细胞体外培养的不稳定性、使用外源血清、使用饲养层细胞、流式结果低、因包被操作繁琐和增加染菌风险等因素，通过贴壁去除抑制NK细胞激活的单核细胞，然后用IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、CD16单克隆抗体刺激诱导NK细胞，用CTLA-4与CD28竞争性结合T细胞激活受体从而抑制T细胞激活，再用含有IL-2、IL-15的无血清完全培养基扩增，得到稳定的大量高纯度的NK细胞。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种去单核体外培养NK细胞的方法，包括以下步骤：

(1)分离血清和全血细胞：取50mL血液置于离心管中离心，获得血清和全血细胞；

(2)灭活血清；

(3)获取单个核细胞；

(4)贴壁培养单个核细胞：第0d收集的单个核细胞，分出0.6-10×10⁷数量的细胞，用40mL贴壁培养基重悬后，转入培养瓶，置于37℃、5％CO₂的培养箱中贴壁2h，贴壁结束后弃贴壁的单核细胞，收集悬浮细胞待用；