[发明专利]一种去单核体外培养NK细胞的方法

权利要求书

1.一种去单核体外培养NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离血清和全血细胞：取50mL血液置于离心管中离心，获得血清和全血细胞；

(2)灭活血清；

(3)获取单个核细胞；

(4)贴壁培养单个核细胞：第0d收集的单个核细胞，分出0.6-10×10⁷数量的细胞，用40mL贴壁培养基重悬后，转入培养瓶，置于37℃、5％CO₂的培养箱中贴壁2h，贴壁结束后弃贴壁的单核细胞，收集悬浮细胞待用；

(5)激活单个核细胞：悬浮细胞用40mL含有10％血清的激活培养基重悬，转入培养瓶中，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养3d；

(6)诱导NK细胞：第3d补加50mL含有10％血清的激活培养基；第5d补加100mL含有10％血清的激活培养基；

(7)扩增NK细胞：第7d后，每2d补加扩增培养基，并控制细胞浓度在1.0×10⁶/mL；培养至第13-20d后将细胞培养液转入离心管，离心500-1000g，10-20min，用生理盐水洗涤2-3次，即获得高纯度，高活性的NK细胞；

其中，步骤(5)和(6)的激活培养基为添加有lL-2、lL-12、lL-15、lL-18、CD16单克隆抗体和CTLA-4的无血清培养基；步骤(7)的扩增培养基添加有lL-2和lL-15的无血清培养基。

2.根据权利要求1所述的去单核体外培养NK细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中需要对血液进行检测：血液梯度离心获取单个核细胞后，检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体、人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体和巨细胞病毒lgM抗体均为阴性。

3.根据权利要求1所述的去单核体外培养NK细胞的方法，其特征在于，步骤(2)灭活血清的具体操作为：血清放入56℃水浴中灭活20min后，置于-20℃环境中速冻15min，离心1500g，30min，得到清澈的血清，置于2-8℃环境中保存。

4.根据权利要求1所述的去单核体外培养NK细胞的方法，其特征在于，步骤(3)获取单个核细胞的具体操作为：全血细胞与生理盐水1：1稀释后，按1：2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，650g，升1降0，离心30min，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞。

5.根据权利要求1所述的去单核体外培养NK细胞的方法，其特征在于，步骤(4)贴壁培养基为含有2-10％血清的无血清培养基。

6.根据权利要求1所述的去单核体外培养NK细胞的方法，其特征在于，lL-2的浓度为100-3000lU/mL、lL-12的浓度为5-100ng/mL、lL-15的浓度为10-200ng/mL、lL-18的浓度为10-200ng/mL、CD16单克隆抗体的浓度为50-200ng/mL、CTLA-4的浓度为0.1-20μg/mL。

7.根据权利要求1所述的去单核体外培养NK细胞的方法，其特征在于，lL-2的浓度为100-3000lU/mL、lL-15的浓度为10-200ng/mL。