[发明专利]硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用，属于有机化学和生物化学领域。本发明以硅原子取代的罗丹明衍生物为基础骨架，通过进行不同形式的芳香胺的修饰，合成了具有大斯托克斯位移、高荧光强度能够标记免疫球蛋白IgG的硅基罗丹明荧光染色试剂，从而可用于体外SARS‑CoV‑2病毒特异性抗体荧光ELISA检测。本发明的硅基罗丹明荧光染色试剂具有较大的斯托克斯位移(＞140nm)可以有效避免激发和发射光的相互干扰，检测灵敏度高，基于该荧光抗体建立的荧光ELISA检测方法能够适用于不同带宽的酶标仪，应用范围广。

技术领域

本发明涉及有机化学和生物化学领域，尤其涉及免疫学技术领域，具体涉及一种硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用。

背景技术

SARS-CoV-2病毒是引起2019严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratorysyndrome，SARS)的一种新型冠状致病病原体，感染者以呼吸道症状和肺炎为主要临床表现。2020年2月药物国际病毒分类委员会将该病毒正式命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将疾病命名为2019冠状病毒病(2019corona virusdisease，COVID-19)。SARS-CoV-2病毒传播能力强、潜伏时间长、发病率高，传统的病毒防御措施控制效果不佳，全球大流行趋势明显，病毒防控形势严峻。

SARS-CoV-2属于β属冠状病毒B亚群。高分辨电子显微镜观察，SARS-CoV-2病毒表面存在日冕状突起，形似王冠。基因测序分析显示，SARS-CoV-2与SARS-CoV存在80％的同源性和MERS-CoV有50％的同源性。SARS-CoV-2病毒包含有棘突蛋白S(Spike)、基质蛋白M(matrix)，包膜蛋白E(Envelope)和核蛋白N(nuclearprotein)等结构蛋白。其中，S蛋白包含S1和S2两个片段。S1蛋白是病毒与宿主细胞识别的关键蛋白，以高亲和力与细胞表面的血管细胞受体血管紧张肽转化酶2(angiotensin.Convertingenzyme 2,ACE2)结合，具有抗原性和免疫原性。因此，S1蛋白也被作为抗病毒药物筛选和新型疫苗制备的主要靶点。

高传染性COVID-19在全球范围内蔓延，目前，快速、灵敏、安全地检测SARS-CoV-2病毒依然是病毒防控的关键。基于核酸检测的方法如实时定量PCR、恒温PCR等。虽然核酸检测的灵敏度较高，但仍然存在样本取样差异大、前期处理过程复杂、对实验操作人员的要求高、检测实验室需具有P2级以上生物安全级别以及样本需要冷链运输等问题，给感染者的快速排查带来一定的难度。与核酸检测的方法不同，酶联免疫结合方法(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay,ELISA)的样本为全血或血清，与咽拭子相比，血样中病毒载量低、取样方便、操作简便、结果稳定、对实验室的要求性相对较低。因此，血清抗体的ELISA检测可以作为病毒核酸检测的有效补充或替代方法。

ELISA法是利用抗原和抗体特异性结合的原理对特定的抗原或血清抗体进行检测的方法。SARS-CoV-2病毒侵染宿主后，由于病毒表面蛋白的抗原性，而激活宿主自身的免疫应答过程。免疫细胞活化、增殖产生免疫效应物质抗体。COVID-19患者在感染SARS-CoV-2病毒后14天，即可在血清中检测到特异性免疫球蛋白IgG。

荧光法ELISA是将荧光染料通过特定的反应官能团与二抗IgG进行偶联，二抗与一抗特异性结合后，通过测定荧光强度值反映样本中抗原或抗体的含量。与紫外吸光法相比，荧光法具有检测灵敏度高、无需特定的底物、操作步骤较少、结果稳定可重复等优点，适用于免疫检测试剂盒的开发。但是，传统的染料如：花菁类、酞菁类和荧光素等由于斯托克位移小，在带宽为18nm的光栅式或滤光片式常规酶标仪中均存在激发光和发射光相互干扰的情况，限制了荧光法在ELISA检测中的应用。

因此，开发大斯托克位移、高荧光强度的荧光染料，并高效标记免疫球蛋白IgG，对于建立高灵敏度的荧光ELISA并用于SARS-CoV-2病毒特异性抗体检测具有重要的意义。

发明内容