[发明专利]检测大肠杆菌内氟含量的方法

说明书

本发明属于微生物检测领域，涉及一种检测大肠杆菌内氟含量的方法，包括：1）配制含有不同浓度氟的LB液体培养基；2）在LB液体培养基中加入野生型大肠杆菌菌株并振荡培养；3）紫外检测在野生型大肠杆菌生长的OD600值；4）收集培养的菌液后离心，倒掉上清液，重悬浮再离心后倒掉上清液后再重悬浮，水浴加热，冷却后离心；5）取上清液，用氟离子选择性电极进行测定，得到氟离子浓度C；6）计算得到野生型大肠杆菌内累积的氟含量。本发明提供了一种检测大肠杆菌内氟含量的方法，为含氟抗菌药物的研发提供浓度参考和配比依据，解决含氟抗菌药物研发时无法分别确定药物中氟和致死成分的有效浓度的问题。

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及一种检测大肠杆菌内氟含量的方法。

背景技术

大肠杆菌是一种条件致病菌，在合适的条件下能够寄居在人或动物的肠道内，容易引发胃肠道感染等疾病。大肠杆菌感染的发生与流行传播是呈世界性分布并具有区域性分布的特点，尤其是患病或带菌的动物往往会成为动物来源食品污染的根源，如来自带菌牛的牛肉或奶制品，来自带菌鸡的鸡蛋或鸡肉制品。而且患病或带菌动物也可通过排泄的粪便来污染当地的草场、水源等，从而造成交叉污染，甚至会区域性爆发大肠杆菌疫情。大肠杆菌感染后症状较轻的通常只会引起腹泻，但对于免疫力本身就低下的婴幼儿、年长者及患者，严重的会引发大肠杆菌性脑膜炎、败血症等疾病。因此抗菌治疗及抗菌药物的研发十分重要。

在进行抗大肠杆菌治疗时，常用氟喹诺酮类，如诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星等这类含氟的抗菌药物。含氟药物具有用量少、毒性低、药效高、代谢功能强等特点。但含氟药物的广泛使用和滥用，导致大肠杆菌对药物的敏感性逐渐降低，耐药大肠杆菌出现并快速传播着。大肠杆菌的耐药机制主要分为两类，一类是基因突变或蛋白变化导致的抗生素作用位点改变或者是大肠杆菌自身产生了破坏抗生素结构的酶类，这一类机制会使得抗生素中的致死成分失效或活性减弱；另一类机制是与抗生素摄入有关的，大肠杆菌发生突变导致的某种特异膜孔蛋白丢失或发生形状或数量的改变，致使抗生素的通透性降低，或者是大肠杆菌自身的主动外排系统将药物选择性或非选择性地排出了细胞，这一类机制会使得进入细胞的药物量减少，因此抑菌作用减弱。

含氟药物中的氟主要发挥增加药物脂溶性、增强对组织细胞的穿透力的作用，能够很大程度上帮助增加药物中致死成分的抗菌谱和杀菌效果，因此适当增加药物中氟的比例能够有效抑制耐药大肠杆菌的生长。但也不能为了抑菌效果一味增大氟的比例，因为氟摄入量超标会增加氟中毒的风险，因此药物中残留的氟如果过多也会反过来伤害人体。在药物研发时，常利用外源施加含氟药物来处理大肠杆菌，通过判断大肠杆菌的生长活性来找到抑制大肠杆菌的药物浓度。常规的药敏试验只能判断出抑菌药物的有效浓度范围，无法分别确定药物中氟和致死成分的有效浓度。但若通过测定大肠杆菌中累积的氟含量就可以得到直接发挥作用的氟成分浓度，可以帮助调整合成抗菌药物的成分配比。

发明内容

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种检测大肠杆菌内氟含量的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测大肠杆菌内氟含量的方法，所述检测大肠杆菌内氟含量的方法包括以下步骤：

1)配制含有不同浓度氟的LB液体培养基；

2)分别向步骤1)配置得到的含有不同浓度氟的LB液体培养基中加入野生型大肠杆菌菌株并振荡培养；

3)紫外检测在含有不同浓度氟的LB液体培养基中野生型大肠杆菌生长的OD600值；

4)分别收集步骤3)中培养的菌液后离心，倒掉上清液，重悬浮再离心后倒掉上清液后再重悬浮，水浴加热，冷却后离心；

5)取步骤4)中最后得到的上清液，用氟离子选择性电极进行测定，得到氟离子浓度C；