[发明专利]一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用

说明书

一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用，属于基因工程领域。为了提高衣康酸的产量，本发明提供了一种产衣康酸的重组土曲霉菌株，是在出发菌株中过表达玉蜀黍黑粉菌的反式乌头酸脱羧酶而获得的；出发菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)；所述反式乌头酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述反式乌头酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供重组菌株的衣康酸发酵产量普遍高于出发菌株，其中产量最高的菌株在摇瓶水平上比出发菌株提高了约50％，具有很强的应用价值。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用。

背景技术

衣康酸(itaconic acid)是目前在聚合物工业中用作单体或共聚单体，主要用于合成腈纶化纤、树脂、塑料、橡胶、涂料、表面活性剂、高分子螯合剂、造纸、医药、农药、轻工、食品、丝绸等领域,也被鉴定为哺乳动物体内产生的具有抗菌活性的代谢物。

在土曲霉中，衣康酸的代谢途径是由三羧酸循环分流出来的，三羧酸循环中的顺乌头酸在顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)的催化作用下脱羧形成衣康酸。玉蜀黍黑粉菌Ustilago maydis是另外一种能天然合成衣康酸的微生物，2016年研究人员发现玉蜀黍黑粉菌的衣康酸合成途径与土曲霉有差异，它是利用反式乌头酸作为前体，在反式乌头酸脱羧酶(trans-aconitate decarboxylase，Tad1)的催化作用下脱羧形成衣康酸(Elena Geiser,Sandra K Przybilla,Alexandra Friedrich et al,Ustilagomaydis produces itaconic acid via the unusual intermediate trans-aconitate.Microbial Biotechnology,2016,9,116–126)。

近几十年来提高衣康酸产量的尝试集中在进行传统诱变筛选高产菌株和发酵工艺优化等方面，但都没有使得衣康酸的发酵产量得到重大突破。

发明内容

为了提高衣康酸的产量，本发明提供了一种产衣康酸的重组土曲霉菌株，所述重组土曲霉菌株是在出发菌株中过表达玉蜀黍黑粉菌的反式乌头酸脱羧酶而获得的；所述出发菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)。

在本发明的一个实施例中，所述出发菌株为土曲霉CICC40205、土曲霉NRRL1960、土曲霉DSM23081、土曲霉TN484或土曲霉TN484-M1。

在本发明的一个实施例中，所述反式乌头酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个实施例中，编码所述反式乌头酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示。

在本发明的一个实施例中，所述重组土曲霉菌株中含有反式乌头酸脱羧酶的表达盒，所述表达盒由构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdAt、反式乌头酸脱羧酶基因和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC组成。

在本发明的一个实施例中，所述反式乌头酸脱羧酶的表达盒核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

本发明还提供了上述产衣康酸的重组土曲霉菌株的构建方法，是在土曲霉菌株中导入编码所述反式乌头酸脱羧酶的基因构建获得重组土曲霉菌株。

在本发明的一个实施例中，所述重组土曲霉菌株的构建方法，步骤如下：

1)反式乌头酸脱羧酶表达盒的制备：将反式乌头酸脱羧酶tad1基因针对土曲霉表达进行密码子优化，优化后的反式乌头酸脱羧酶tad1基因的5’端与构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdAt相连，3’端与构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC相连，连接后获得反式乌头酸脱羧酶表达盒；