[发明专利]一种美曲普汀的制备方法

说明书

本发明公开了一种美曲普汀的制备方法，具体是美曲普汀基因通过原核表达系统表达获得包涵体，包涵体进行溶解，再进行疏水层析复性，获得美曲普汀蛋白。包涵体溶解和疏水层析复性均采用温和的方式进行，过程中还可以添加抗氧化剂和/或金属螯合剂，以抑制目的蛋白的氧化、降解。该方法制备美曲普汀，易于实现产业化放大，复性效率高，收得率高，生物活性好。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种美曲普汀的制备方法。

背景技术

美曲普汀(Metreleptin)是大肠杆菌表达系统表达的重组人瘦素衍生物(rmetHuLeptin)，含有147个氨基酸残基，与天然人瘦素蛋白相比，其N末端多一个甲硫氨酸残基，故又称为重组人甲硫氨酰瘦素蛋白。美曲普汀无糖基化修饰，其第97位半胱氨酸残基与第147位半胱氨酸残基形成链内二硫键，封闭其C-末端，相对分子量约为16.15k Da。2014年2月24日，美国FDA批准美曲普汀制剂上市(商品名：Myalept，Amylin公司产品)，用作补充疗法治疗先天性或获得性脂肪代谢障碍患者瘦素缺乏并发症，制剂规格：11.3mg/支。

大肠杆菌(E.coli)表达系统，因其基因组信息研究清晰、基因操作简便，而为学术界和工业界广泛应用。但大肠杆菌细胞内缺乏氧化还原环境和翻译后加工修饰机制，所以许多大肠杆菌表达系统重组表达的外源性蛋白均无法正确折叠，从而形成不可溶的包涵体(IBs)。包涵体中主要是部分折叠或者错误折叠的目的蛋白的聚集体。要从包涵体中得到正确折叠，具有天然生物学活性的蛋白，通常采用复杂的“变性-复性”过程：首先使用高浓度的变性剂如8M尿素或6M盐酸胍溶解包涵体，将目的蛋白二级结构完全打开(变性)，再通过合适溶液使目的蛋白重新折叠，形成正确的结构(复性)。

用大肠杆菌表达系统表达制备重组人瘦素蛋白或者其衍生物时，目的蛋白也主要以包涵体形式表达，获得有生理活性的瘦素蛋白通常使用的方法也是使用盐酸胍或尿素溶解后再复性。但这种包涵体的溶解方式会完全破坏蛋白质的结构，包括所有的二级结构，这样在蛋白质的复性(重折叠)过程中，容易折叠错误，引起蛋白聚集沉淀，从而复性失败，或者复性效率低，导致蛋白收得率低。常规复性采用稀释复性或透析复性方式，逐步脱除变性剂(尿素或盐酸胍)，在变性剂浓度逐级降低的同时目的蛋白会折叠、形成正确构象。由于稀释复性或透析复性方式很难真正实现变性剂浓度逐级降低，变性剂浓度的骤然下降时目的蛋白还来不及折叠成正确构象，往往形成错误构象，并聚集沉淀，导致复性效率低下；通常稀释复性或透析复性时包涵体溶解液与复性液的比例高达1:50～1:100，也不利于产业化放大或者放大成本高。因此，有必要开发一种易于产业化放大、收得率高的美曲普汀制备方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的美曲普汀在生物工程制备过程中常以包涵体形式存在，要经过复杂的变性、复性过程，难于产业化放大、收得率低等问题，本发明提供了一种新的美曲普汀的制备方法，整体技术方案是以原核表达系统表达美曲普汀，制得包涵体，采用一种较温和的方式溶解包涵体，并采用疏水层析进行复性。用该方法制备美曲普汀，易于实现产业化放大，复性效率高，收得率高。

下面详述本发明的技术方案：

一种美曲普汀的制备方法，美曲普汀基因通过原核表达系统表达获得包涵体，包涵体进行溶解，再进行疏水层析复性，获得美曲普汀蛋白；

所述溶解使用的溶解液为0.5M～1M的Arg，pH 12，溶解温度为2～8℃，溶解时间为3～18小时；

所述疏水层析复性包括以下步骤：

(1)将溶解后的包涵体溶液中，加入等体积含4M NaCl的溶解液，然后上样至预平衡好的层析柱；所述层析柱为经过平衡液1平衡3～5个柱床体积的Phenyl Fast Flow 6(high)层析柱；

(2)上样完毕后，用平衡液1复平衡层析柱；再依次从平衡液1到平衡液2梯度洗脱3～10个柱床体积，平衡液2到复性液1梯度洗脱3～10个柱床体积，复性液1到复性液2梯度洗脱3～10个柱床体积；