[发明专利]一种特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列及其重组完整抗体

说明书

本发明公开了一种特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了一种抗噻虫啉重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。本发明又公开了一种抗体表达质粒。将本发明得到的序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组完整抗体，保证了鼠源亲本抗体的识别活性，并使得抗噻虫啉抗体可大批量稳定生产，为噻虫啉残留检测的各种免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列及其重组完整抗体的制备。

背景技术

噻虫啉(3-(6-氯-3-甲基吡啶)-1，3-噻唑烷-2-亚氰胺)是一种具有噻唑环的新型氯代烟碱类杀虫剂，因其结构独特，性能与传统烟碱类杀虫剂相比更为优异，而被广泛应用于防治刺吸式口器和咀嚼式口器害虫对农作物的危害。噻虫啉有较强的内吸和渗透作用，因此会分布在作物各个部位，且因其具有水溶性强和半衰期长等特点，很容易通过降雨和灌溉等途径进入到地表水和土壤中。研究表明，地表水、沉积物和土壤中存在着较高水平的噻虫啉残留，这些农药残留对蜜蜂等传粉动物、水生和土壤无脊椎动物造成了巨大威胁。还有研究认为，噻虫啉对人类具有潜在致癌性及可能的生殖毒性与内分泌干扰效应，因此2020年欧盟开始实施对噻虫啉的禁用令。为防止消费者和有益生物受到噻虫啉残留的危害，对环境和农产品中噻虫啉残留的及时监测具有重要的意义。

目前，针对噻虫啉残留的检测方法主要有基于仪器的检测方法和基于免疫分析的检测方法。仪器分析方法有HPLC、GC和MS等，这些仪器分析方法均具有很高精密度、准确度和灵敏度，能够满足噻虫啉的精准定性定量的检测要求，但仪器分析方法需要昂贵的分析仪器、专业的实验人员和复杂的样品前处理程序，因此很难实现大规模的现场快速分析，而免疫分析快速检测方法能满足农药残留现场检测以及大批量样本筛查的需求。

目前，已有抗噻虫啉单抗及其免疫快速检测方法的少量公开报道，例如Yin等人报道的基于噻虫啉抗体和抗原模拟表位多肽建立的ELISA方法对噻虫啉的检测灵敏度(IC₅₀)和最低检测限(IC₁₀)分别是26.3和1.4μg/L(Yin,W.；Hua,X.；Liu,X.；Shi,H.；Gee,S.J.；Wang,M.；Hammock,B.D.,Anal.Biochem.,2015,481,27–32.)。Ding等人报道的基于传统单抗建立的ELISA方法对噻虫啉的IC₅₀和IC₁₀分是2.31ng/mL和0.44ng/mL(Ding,Y.；Chen,H.；Yang,Q.；Feng,L.；Hua,X.；Wang,M.,RSC Adv.,2019,9,36825–36830.)。

农药免疫分析快速检测技术是基于农药抗原和抗体的特异性结合而实现的，故抗体的制备是农药免疫快速检测的核心关键。传统的抗体有多克隆抗体和单克隆抗体，均是通过免疫动物而制备的，且后者因只有一个抗原识别表位特异性强而被广泛应用于农药免疫分析快速检测。依赖杂交瘤细胞制备单克隆抗体这一技术生产成本高、耗时，且需要杂交瘤细胞的长期低温保存和定期驯化，但在这些过程中杂交瘤细胞会因保存条件不当，有效基因丢失或突变而无法产生有效的抗体。随着基因工程技术的发展，序列明确的重组抗体逐渐变成研究热点，包括单链抗体、Fab抗体、重组完整抗体等。在众多重组抗体表达系统中，哺乳动物细胞表达系统能够指导重组抗体的正确折叠，提供准确的多种翻译后的加工和修饰功能，因此可以稳定产生与亲本抗体活性一致的重组抗体，不仅证实了亲本抗体可变区序列的准确性，还可以解决常规抗体制备面临的许多问题，如传统抗体的批次间差异、细胞株传代保存过程中容易丢失有效基因而导致细胞株无法产生有效抗体。只要获得正确的抗体序列基因，就可以在体外大量制备多种形式的重组抗体(包括全长IgG完整抗体、单链抗体scfv、抗原识别片段Fab等)，而无需牺牲小鼠来制备腹水抗体，操作简便，制备周期短，有利于大规模产生抗体，并有助于灵敏、可靠的农药残留快速检测技术的发展和应用。