[发明专利]海洋源产PHA菌富集培养及接种、PCR扩增基因方法

说明书

本发明涉及海洋源产PHA菌富集培养及接种、PCR扩增基因方法。接种方法：⑴以1:100的比例将海洋沉积物与MM1培养基混合，在摇床中充分摇晃培养一个周期，培养后的沉积物和培养基混合物称为富集培养液；将当前MM1培养基中的富集培养液，以1:100的比例接种至下一个梯度的MM2培养基中，以此类推，完成6～8个周期的富集培养，所述一个周期为7～10天；⑵每富集完成2～3个周期后，进行一次分离，⑶通过菌落PCR扩增所述纯化的单菌落的phaC合成酶基因，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，根据凝胶上是否有明显的条带判断菌株是否产PHA，并利用PCR扩增16Sr RNA基因，一代测序来鉴定菌株的分类地位。

技术领域

本发明涉及细菌富集培养、PCR扩增基因的技术领域，特别涉及一种海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集培养基配置方法、接种方法、利用聚合酶链式反应(PCR)扩增16Sr RNA基因序列的方法及扩增phaC合成酶基因的方法。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由细菌合成的一类3-羟基脂肪酸组成的线型聚酯。这种材料具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的热加工性能，是目前生物医用材料领域和生物可降解包装材料领域的热点材料。

菌株的phaC合成酶的底物特异性和合成效率直接影响构成PHA的单体种类、单体排布方式和PHA分子量大小，从而获得不同生物降解性、热塑性、延展性和通气性等理化性质的材料。这些材料可用于生产膜、袋和瓶以及心脏瓣膜等。目前，推测PHA的结构超过150种，但是，实现大规模商业化生产的PHA种类只有4大类。因此，从环境中获得新型phaC合成酶，对开发新型PHA有重要意义。

发明内容

本发明的目的是解决产PHA细菌分离效率低的问题，提出从海洋沉积物中，以梯度提高培养基含油量和含盐量的方式驯化和筛选菌株，利用含油培养基获得海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集分离方法。本发明的另一目的是提供一种以海洋沉积物为分离对象，以周为时间单元，梯度提高培养基的盐度和含油量，富集细菌群落中能可代谢油类的细菌，并通过极限的培养条件，增加获得不常见菌株的可能性的海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集分离方法。

本发明的第一技术解决方案是所述海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集培养基的配置方法，其特殊之处在于，富集培养基使用盐度和含油量梯度增加的基本培养基(minimal medium，MM培养基)，培养基的配置方法，包括以下步骤：

⑴富集培养基以MM培养基为基础添加油和盐，将1mL微量元素，溶解于1L的0.1mol/L HCl中；

⑵富集培养基中按照设定比例添加油类和氯化钠(NaCl),所述MM培养基的含油量从1％开始，每个培养周期后提高0.5～1％含油量，含盐量从陈海水盐度从35‰开始，每个培养周期后，通过添加氯化钠(NaCl)，盐度提高为10‰；每个培养周期使用的梯度提高比例的MM培养基，以所在周期命名；

⑶调节培养基的pH值到7.4，在121 ℃下，高压灭菌20min。

作为优选：步骤⑴所述MM培养基由以下质量分数wt％组成：

Na₂HPO₄ 0.38 KH₂PO₄ 0.265 (NH₄)₂SO₄ 0.05

MgSO₄ 0.02 CuSO₄·6H₂O 0.0155 ZnSO₄·7H₂O 0.0153