[发明专利]海洋源产PHA菌富集培养及接种、PCR扩增基因方法

权利要求书

1.一种海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集培养基的配置方法，其特征在于，富集培养基使用盐度和含油量梯度增加的基本培养基(minimal medium，MM培养基)，培养基的配置方法，包括以下步骤：

⑴富集培养基以MM培养基为基础添加油和盐，将1mL微量元素，溶解于1L的0.1mol/LHCl中；

⑵富集培养基中按照设定比例添加油类和氯化钠(NaCl),所述MM培养基的含油量从1％开始，每个培养周期后提高0.5～1％含油量，含盐量从陈海水盐度从35‰开始，每个培养周期后，通过添加氯化钠(NaCl)，盐度提高为10‰；每个培养周期使用的梯度提高比例的MM培养基，以所在周期命名；

⑶调节培养基的pH值到7.4，在121℃下，高压灭菌20min。

2.根据权利要求1所述海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集培养基的配置方法，其特征在于，步骤⑴所述MM培养基由以下质量分数wt％组成：

3.一种海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集的接种方法，其特征在于，包括以下步骤：

⑴以1:100的比例将海洋沉积物与MM1培养基混合，在摇床中充分摇晃培养一个周期，培养后的沉积物和培养基混合物称为富集培养液；将当前MM1培养基中的富集培养液，以1:100的比例接种至下一个梯度的MM2培养基中，以此类推，完成6～8个周期的富集培养，所述一个周期为7～10天；

⑵每富集完成2～3个周期后，进行一次分离，得到形态、颜色均一的单菌落；

⑶通过菌落PCR扩增所述纯化的单菌落的phaC合成酶基因，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，根据凝胶上是否有明显的条带判断菌株是否产PHA，并利用PCR扩增16S rRNA基因，一代测序来鉴定菌株的分类地位。

4.根据权利要求3所述海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集的接种方法，其特征在于，步骤⑵所述的分离步骤进一步包括：

(2.1)快速摇动富集培养液30s使沉积物悬浮，然后取30μL悬浮液进行梯度稀释，每个稀释度涂布至2216E培养基表面，在30℃下培养2～7天；

(2.2)每天根据菌落的形态特征，利用三区划线的方法纯化菌落，直到得到颜色形态均一的单菌落。

5.根据权利要求3所述海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集的接种方法，其特征在于，步骤⑵所述分离出的菌落包括：通过所属分离获得厚壁菌门菌株11株，变形菌门菌株36株，其中21株菌株含有phaC合成酶基因，分离的潜在的产PHA菌株高达45％；获得菌株来自11个属，包括：尖球菌属(Acuticoccus)、食烷菌属(Alcanivorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)、喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)、布伦茨氏菌属(Labrenzia)、Maritimibacter菌属、远洋橄榄球形菌属(Pelagibaca)、Ponticaulis菌属、假单胞栖海洋菌属(Pseudooceanicola)、Salipiger菌属和Thalassospira菌属。

6.一种利用聚合酶链式反应(PCR)扩增16Sr RNA基因序列鉴定菌株分类地位的方法，其特征在于，包括以下步骤：

⑴引物为：27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1472R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；

⑵PCR反应条件为首先在94℃下变性6min，然后在94℃下45s，54℃下30s，72℃下90s反应一个循环，共30个循环，最后在72℃下10min；

⑶利用NCBI的BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，确定与该序列最相似的模式菌株，初步判断菌株的分类地位。

7.一种利用聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定菌株潜在合成PHA能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

⑴引物为：phaC1F1(5’-TGGARCTGATCCAGTAC-3’)和phaC1R1(5’-CGGGTTGAGRATGCTCTG-3’)；

⑵PCR反应条件：94℃下变性5min，然后以94℃下1min，54℃下1min，72℃下1min为一个反应循环，共反应30个循环，最后在72℃下延伸10min；

⑶PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，使用1％琼脂糖，电压120V下分离15min分钟，确定菌株有清晰的条带，表征细菌具有phaC合成酶基因。