[发明专利]一种基于实验鱼胚胎和基因表达快速筛选脂代谢药物的方法

说明书

本发明公开了一种基于实验鱼胚胎和基因表达快速筛选脂代谢药物的方法。以诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)的胚胎作为实验材料，用待测药物浸泡胚胎，检测药物是否对诸氏鲻虾虎鱼胚胎的脂代谢产生影响，进而筛选脂代谢药物。本发明能有效降低检测成本，较传统检测方法节省成本60％以上；同时在保证实验数据准确、可重复的基础上，针对取材和基因检测关键环节减少了时间点，为高效快速的批量检测方法提供了可能。

技术领域：

本发明属于医药生物技术领域，且涉及以实验鱼胚胎为模型，筛选促进脂代谢稳态的小分子化合物的方法，具体涉及一种基于实验鱼胚胎和基因表达快速筛选脂代谢药物的方法。

背景技术：

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是脂质沉积导致的肝脏疾病，以大泡性脂肪变性或脂肪肝为特征，包括从单纯性脂肪变性到伴有炎症的脂肪变性(脂肪性肝炎；NASH)、纤维化和肝硬化(Neuschwander-TetriCaldwell,2003)。据统计，我国发达地区成人NAFLD患病率高达15％，是慢性肝病的首要原因(Wangetal.,2014)。

NAFLD是一种复杂的疾病，其成因与许多因素有关，包括遗传、代谢综合征和/或外部因素，如饮食和锻炼(Buzzettietal.,2016)。同时，研究表明游离脂肪酸、游离胆固醇的升高均能促进NAFLD的发生发展(Cusi,2009)。三磷酸腺苷结合盒转运子基因(ABCA1)是ABC转运蛋白家族中的一员，研究表明其在调节NAFLD病理进程中的胆固醇稳态和胰岛素抵抗方面具有重要作用。临床数据显示NASH患者肝细胞中ABCA1活性降低会导致肝脏胆固醇沉积和肝脏损伤(VanRooyenetal.,2011)。用西洛他唑增强ABCA1的表达能改善肝脂肪变性，是治疗肝脂肪变性的一个潜在的治疗途径(Jeonetal.,2015)。此外，血管紧张素转换酶(ACE2)主要在肝脏中表达，最新的研究表明ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴基因能抑制肝脏胰岛素抵抗的研究，是NAFLD药物治疗的一个潜在靶点(Caoetal.,2016)。迄今，尚无针对NAFLD的有效治疗方法，亦无临床药物批准上市。但相关的药物研发工作非常活跃，大约有95种药物处于不同的研发阶段，此外，大量的中草药被开发用来作为肝保护药物(Yanetal.,2020)。

NAFLD的药物筛选、药效评价均需要合适的动物模型，目前相关动物模型主要是通过高脂喂养、基因突变及四氯化碳(CCl4)等化学试剂诱导等方式构建的大/小鼠模型，这些模型已用于疾病机制和药物干预研究。但针对单纯性脂肪变性的动物模型较少，一般采用高脂饲料投喂大小鼠或斑马鱼获得，但此种造模方法一般实验周期超过7周，且伴随有炎症现象(Carmiel-Haggaietal.,2005；Chaoetal.,2014)。同时，大/小鼠模型的构建、维护成本较高，对饲料和药物的消耗量较大；采用CCl4腹腔注射等毒性损伤下的大/小鼠模型，会因毒性导致死亡率上升，从而使造模成功率下降，限制了其应用。因此能否筛选自发性易感动物模型用于NAFLD研究，并建立一种快速筛选方法极为重要。

发明内容：

本发明的目的提供一种基于实验鱼胚胎和基因表达快速筛选脂代谢药物的方法，利用本发明的方法可以保证模拟性高、重复性好、可靠性强、成本低廉。

本发明的基于实验鱼胚胎和基因表达快速筛选脂代谢药物的方法，其是诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobiuschulae)的胚胎作为实验材料，用待测药物浸泡胚胎，检测药物是否对诸氏鲻虾虎鱼胚胎的脂代谢产生影响，进而筛选脂代谢药物。

优选，所述的检测药物是否对诸氏鲻虾虎鱼胚胎的脂代谢产生影响是于胚胎发育24h，48h和72h取样进行脂质代谢相关靶基因表达的检测，同时检测48h胚胎表型。

优选，所述的靶基因是ABCA1和/或ACE2。

优选，还设置有正常发育胚胎作为阴性对照组，靶基因沉默+激动剂处理作为阳性对照组。