[发明专利]一种斑马鱼难治性癫痫模型的构建方法及应用

权利要求书

1.一种斑马鱼难治性癫痫模型的构建方法，其特征在于将突变人GABRG2基因转入斑马鱼使其成为具有难治性癫痫表型的斑马鱼系，所述的突变人GABRG2基因为人GABRG2基因第282位脯氨酸密码子突变为丝氨酸。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述人GABRG2基因第282位氨基酸脯氨酸密码子中碱基C突变为T。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述转入的突变人GABRG2基因序列如SEQID No：1所示。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于表达载体为pDestTol2CG2。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于采用gateway技术构建表达载体。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)GABRG2突变体表达载体的构建：合成突变人GABRG2基因，将其克隆至pME-MCS质粒载体，构建得到middle entry clone:pME-GABRG2^844CT；克隆含HuC神经元特异性启动子区序列，构建载体5’entry clone：p5E-HuC和3’entry clone：p3E-polyA；通过Gateway LR反应将5’entry clone、middle entry clone和3’entry clone载体重组克隆至表达载体pDestTol2CG2中，获得表达载体：pDestTol2CG2；HuC:GABRG2^844CT-polyA。

(2)显微注射斑马鱼胚胎：将上述GABRG2突变体表达载体和Tol2转座酶/转座酶mRNA显微注射于1-2细胞期的野生型斑马鱼受精卵中，待胚胎发育至24hpf后，筛选心脏表达绿色荧光的胚胎获得含GABRG2突变体序列的阳性斑马鱼。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于所述pDestTol2CG2；HuC:GABRG2^844CT-polyA序列如SEQ ID No：6所示。

8.如权利要求1-7任一项所述的构建方法，其特征在于还包括进一步鉴定转基因斑马鱼基因型及获得稳定遗传品系的步骤。

9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于将含GABRG2突变体序列的阳性斑马鱼胚胎发育成熟后，通过PCR鉴定其基因型，挑选含GABRG2突变体序列的阳性斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，获得F1代斑马鱼，并通过心脏表达的绿色荧光以及基因组DNA检测手段，最终筛选获得GABRG2突变体斑马鱼系。

10.采用权利要求1-9任一项所述方法构建的突变型GABRG2转基因斑马鱼癫痫模型在癫痫病理研究和抗癫痫药物筛选中的应用。