[发明专利]油葵自交系离体培养的方法

说明书

本发明公开了油葵自交系离体培养的方法，其包括如下步骤：(1)无菌苗获得：取油葵自交系种子，用纱布包好后消毒，然后将消毒后的种子接种到固体培养基上培养获得无菌苗；(2)不定芽诱导：剪取接种5d日龄的无菌苗子叶节，并垂直叶脉切1‑2个小刀口，接种到不定芽诱导培养基上，诱导不定芽；(3)不定芽生根：当诱导出的不定芽长到1‑2cm时，将芽从外植体上切下转接于生根培养基上诱导生根；(4)当根生长到为3‑5cm时进行炼苗及移栽步骤。本发明以油葵自交系为试材，优化了油葵离体培养获得再生植株的技术方法，为实现油葵遗传转化奠定基础。

技术领域：

本发明属于农业生物技术领域，特别是涉及油葵自交系离体培养的方法。

背景技术：

向日葵(Helianthus annuus L.)是世界重要的油料作物，也是内蒙古地区主要的经济作物。多年来，人们通过常规育种，对向日葵的产量、含油量、抗病虫等特性进行了改良，育成了不少优良向日葵新品种，但常规育种程序繁琐，需时长，且不易将优良性状集中于后代。利用农杆菌介导的植物基因工程技术为向日葵品种改良开辟了新的途径，但是任何目的基因能否转移给受体并获得转基因植株，其中一个首要条件就是必须先建立起离体培养再生植株的方法。前人报道了向日葵根尖、茎尖、幼胚、花药及子房、原生质体、子叶、下胚轴、真叶等外植体再生植株的研究，但向日葵属于难再生的植物，且基因型不同，离体培养外植体选择，及不定芽诱导培养基也会有显著差异。而目前还没有较为成熟的针对油葵自交系离体培养方法。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种油葵自交系离体培养的方法。

本发明的目的由如下技术方案实施：油葵自交系离体培养的方法，其包括如下步骤：

(1)无菌苗获得：取油葵自交系种子，用纱布包好后消毒，然后将消毒后的种子接种到固体培养基上培养获得无菌苗；

(2)不定芽诱导：剪取接种5d日龄的无菌苗子叶节，并垂直叶脉切1-2个小刀口，接种到不定芽诱导培养基上，诱导不定芽；

(3)不定芽生根：当诱导出的不定芽长到1-2cm时，将芽从外植体上切下转接于生根培养基上诱导生根；

(4)当根生长到为3-5cm时进行炼苗及移栽步骤。

优选的，所述步骤(1)消毒方法为：自来水下冲洗0.5-1h，用75％酒精消毒1min，再用0.1％HgC1₂消毒8min，无菌水冲洗3-4次。

优选的，所述步骤(1)中，所述固体培养基为不加任何激素、pH为5.8-6.2的1/2MS固体培养基。

优选的，所述步骤(1)中，培养条件为24-26℃，光照16h/d，培养5天。

优选的，所述步骤(2)中，所述不定芽诱导培养基为MS+6-BA 1.0+IAA0.07+2,3,5-TIBA0.02+AgN0₃ 7.0+L-phe 5.0+KNO₃ 5000.0+CH 500.0+蔗糖30000.0+琼脂7000.0，单位为mg/L，所述不定芽诱导培养基的pH为5.8-6.2。

优选的，所述步骤(3)中生根培养基为MS+IBA 0.5mg/L+琼脂7000.0mg/L。

优选的，所述步骤(4)炼苗及移栽具体方法为：当根生长到3-5cm时，打开瓶盖炼苗4-5d，期间在瓶内补充灭菌水，然后用镊子将培养基轻轻搅破，小心取出小植株，移入事先灭菌的营养土中，浇透水并覆膜保湿于散射光下培养，待苗心开始生长时除去膜，待适应一段时间后，转移到阳光下继续培养。

本发明的优点：本发明选用5d日龄无菌苗的子叶节作为油葵自交系离体培养的外植体，同时配制适宜的不定芽诱导培养基和生根培养基，使得油葵自交系离体培养不定芽诱导率最高可达到77％，生根率为60％，移栽后成活率为33.3％。