[发明专利]一种构建古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法及应用

说明书

本发明公开一种构建古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法及应用。通过构建pET‑32a‑NP载体，转化至E.coli BL21感受态细胞大量培养获得rNP蛋白通过纯化测定，rNP蛋白纯度超过80%，通过使用本发明构建的古尔图病毒抗体间接ELISA检测方法与常规检测方法对比，本发明构建的间接ELISA检测方法的符合率高达92.7%，该检测方法具有特异性强、灵敏度高、结果准确可靠的特点，是一种具有广谱性的检测方法，为古尔图病毒抗体血清流行病学监测提供了简单、快速和成本低廉的技术支持具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学和微生物学领域。具体地讲，本发明涉及一种古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法及其应用的技术领域。

背景技术

古尔图病毒(Guertu virus，GTV)可通过蜱传引起一种人畜共患病，流行病学调查表明草原革蜱是中国西部某地区GTV的主要传播媒介，其平均阳性率为7.89％，高于中国中部长角血蜱携带SFTSV 的阳性率(2.1-5.4％)。草原革蜱是中国西部某地区的一种优势蜱种，是蜱传疾病的重要载体。

GTV基因组由单股、负链RNA组成，分为大(L)、中(M)、小(S) 三段，分别编码RNA依赖的聚合酶、前体囊膜糖蛋白(GP，包括Gn 和Gc)和核蛋白(NP)。NP能够刺激机体发生早期体液免疫和细胞免疫，并且在感染早期体内仅仅只能够测定到NP。据报道，病毒NP 蛋白对于白蛉病毒属的许多成员具有高度免疫原性，并且可作为主要抗原，NP蛋白是病毒体和病毒感染细胞中最丰富的病毒产物。据报道，RVFV的NP蛋白被报道为免疫显性病毒蛋白，感染后早期和恢复期个体很容易检测到抗NP蛋白抗体，为疾病的诊断检测提供了坚实的基础。此外，通过免疫印迹和半定量放射免疫沉淀测定，Toscana 病毒的核蛋白被鉴定为托斯卡纳病毒感染患者中负责IgM和IgG的主要抗原。因此，GTV NP抗原的主要表位和相关的功能意义需要更多的研究。

在Min-Ah Yu等的一项研究中，建立了针对韩国最普遍的SFTSV 毒株(CB1)的基于NP和Gn的ELISA方法。基于NP和Gn的ELISA 方法均显示出对同源性SFTSV CB1株具有很好的一致性。比较结果表明，基于NP的ELISA方法更有利于评估一般血清流行率，因为它具有较高的SFTSV基因型之间的交叉反应性。然而，基于Gn的 ELISA方法可用于建立基因型特异性诊断方法。该研究认为建立的基于NP和Gn的ELISA方法可用于测量动物和人类的感染率。目前，针对GTVNP蛋白的抗原性分析及ELISA方法的建立尚未见报道。

发明内容

针对现有技术未见有关古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法报道的技术现状，本发明旨在提供一种古尔图病毒抗体的间接ELISA 检测方法及其应用。通过使用本发明提供的古尔图病毒抗体的间接 ELISA方法与常规检测方法对比，建立的间接ELISA检测方法的符合率高达92.7％。本发明的ELISA检测方法可为GTV血清流行病学监测提供了简单、快速和成本低廉的技术支持。

因此，为了建立针对GTV的检测方法，本发明通过选取GTV的核蛋白NP作为靶蛋白，建立以纯化得到重组蛋白rNP为包被抗原的间接ELISA方法来测定血清中GTV IgG抗体。本发明为GTV NP蛋白的抗原性研究及针对GTV的检测试剂盒的开发提供了理论基础。

为解决上述的技术问题，本发明通过以下技术方案实现。

本发明利用已分离的古尔图病毒DXM株NP序列进行生物信息学分析，并将设计的带有KpnⅠ和NotⅠ酶切位点的NP基因连接入 pET-32a(+)空载体，将的pET-32a-NP，转化至E.coli BL21感受态细胞大量培养获得rNP蛋白。

本发明具体提供一种古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法，具体步骤如下：