[发明专利]一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法

说明书

本发明涉及一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法，属于大肠杆菌检测技术领域。本发明的方法针对的酶底物为MUG，解决现有技术中采用366nm激发和450nm发射组合，MUG本底经366nm激发后，在450nm也有一定荧光强度，当大肠杆菌浓度很低时4‑MU产量少，产物信号与本底信号分不开，导致对于大肠杆菌浓度极低的水样用现有方法无法检测的技术问题。本发明的用于酶底物法检测大肠杆菌的方法，采用在温育结束之后和荧光测量之前增加一步操作。其操作为用碱性试剂调节至pH≥9，可以使产物4‑MU的吸收峰明显增强，底物MUG吸收峰变化很小，从而将产物信号与本底信号分开。使用本发明的操作使产物信号与本底信号的荧光强度差值增加5倍，突出适用于极低浓度大肠杆菌的检测。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌检测技术领域，具体涉及一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法。

背景技术

大肠杆菌作为粪源性污染的指示微生物，检出意义重大。基于代谢学检测大肠杆菌的方法，因具有检测范围广和准确性高的特点，被广泛采用。通过选择合适的酶底物，如利用E.coli可以产生β-葡萄糖醛酸酶，分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)生成具有荧光的4-甲基伞形酮(4-MU)进行检测。具有该代谢途径的大肠杆菌都可以被检出。目前，基于该酶底物法的大肠杆菌检测方法有两种实现方式。一种方式为，国标法(HJ1001-2018)规定的多孔板方法，通过一定条件下，培养到底物充分反应的时间(MUG几乎全部转化为4-MU)，在紫外灯下计数有荧光的格子，然后查表得出样品中大肠杆菌的最大可能数MPN。但是该方法不能区分加入样品时，每个格子中大肠杆菌的数量差异，在反应的终点(一般为24-48h)，可计数的只能是有荧光和无荧光的格子。另一种方式为，基于4-MU的产量与加样时样品中大肠杆菌浓度在一定时间内成线性关系的原理，建立4-MU的发射峰强度与大肠杆菌浓度的关系，从而检测大肠杆菌。该方法可以给出大肠杆菌的具体浓度值，但是由于底物MUG在产物4-MU的发射峰位置也有荧光强度，所以当样品中大肠杆菌含量极少时，产生的4-MU的量很少，产物信号与底物信号不能分开。

发明内容

本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：

本发明提供一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法，该方法针对的酶底物是4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)；

其特征在于，

在大肠杆菌与酶底物培养基温育结束之后，测量产物荧光之前，增加一步操作；所述操作为以碱性试剂将溶液调节至pH≥9之后，再测量产物荧光。

在上述技术方案中，优选的是：调节溶液pH为9，10，11，或13。

在上述技术方案中，所述碱性试剂包括但不局限于NaOH，KOH，氨水等，优选的是：所述碱性试剂为NaOH、KOH、及氨水中的一种或多种。

在上述技术方案中，进一步优选的是：所述用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法的一种具体实施方式为：

步骤1、配制含MUG成分的培养液；

步骤2、将纯培养大肠杆菌逐级稀释得到的标准样品或者实际待测样品与步骤1的培养液混合；纯培养大肠杆菌标准样品的具体浓度用平板计数法(CFU)定量；

步骤3、将步骤2的培养液于35-44℃温育至产生4-甲基伞形酮；

步骤4、将温育结束后的培养液加碱性试剂调节至pH≥9；

步骤5、测量荧光强度，366nm激发，读取450nm处的发射峰峰值；