[发明专利]一种那屈肝素钙末端结构确认方法

说明书

本发明公布了一种那屈肝素钙末端结构确认方法，包括：(1)用分子排阻色谱‑高分辨质谱联用(SEC‑ESI‑MS)分析那屈肝素钙的完整糖链指纹图谱，确定那屈肝素钙的末端结构(还原末端：6‑O‑磺基‑2，5‑脱水‑D‑甘露醇)。(2)那屈肝素钙样品经过肝素酶I、II、III混合酶降解，通过强阴离子交换色谱分析二糖谱，验证那屈肝素钙二糖中含有末端结构二糖。(3)通过13C核磁共振图谱，确认那屈肝素钙结构中的末端结构。

技术领域

本发明涉及一种那屈肝素钙末端结构分析方法，属于肝素类生化原料药分析技术领域。

背景技术

低分子量肝素(low-molecular-weight heparin，LMWH)是未分级肝素(unfractionated heparin，UFH)中具有较低分子量的组分或片段，具有与UFH相同的母体结构。

LMWH的结构复杂，其中组成LMWH的单糖有10余种，各种单糖的糖环上还有硫酸基、乙酰基等不同的取代基，各种单糖之间的连接方式不同，及取代基的不同或者取代基但取代的位置不同，导致LMWH具有不同的生物活性。不同的LMWH品种，由于生产工艺的不同，其分子量分布、生物活性、抗Xa/抗II活性比、硫酸化程度和末端结构等方面存在差异。

那屈肝素钙是由来源于猪小肠粘膜的肝素经亚硝酸降解后，再经分级选择性去除大部分分子量低于2000道尔顿物质而获得的一种低分子量肝素钙盐。多数组分在其主链的非还原性末端含有个2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸的结构，还原末端含有6-O-磺基-2，5-脱水-D- 甘露醇结构。本内容中的末端结构指还原末端(6-O-磺基-2，5-脱水-D-甘露醇)。

结构鉴定对于仿制药的研发、生产控制和保障药品安全是必不可少的。末端结构鉴定是其中比较重要的一种鉴定。

发明内容

本发明的目的在于明确那屈肝素钙末端结构确定方法，从而建立一套比较完善的那屈肝素钙末端结构分析手段。

本发明的目的可以通过下述技术方案实现：1)使用分子排阻色谱-高分辨质谱联用 (SEC-ESI-MS)分析那屈肝素钙的完整糖链指纹图谱，比较主要糖链分布和糖链结构信息，确定那屈肝素钙的末端结构(还原末端：6-O-磺基-2，5-脱水-D-甘露醇)(见附图1)。2)那屈肝素钙样品经过肝素酶I、II、III混合酶降解，通过强阴离子交换色谱分析二糖谱，验证那屈肝素钙二糖中含有末端结构二糖(见附图2)。3)通过13C核磁共振图谱，确认那屈肝素钙结构中的末端结构(还原末端：6-O-磺基-2，5-脱水-D-甘露醇)(见附图3)。

本发明的测定方法如下步骤所示：

1.1分子排阻色谱与高分辨质谱联用(SEC-ESI-MS)

液相条件：

色谱柱：BEH 200(4.6mm*300mm)串BEH 125(4.6mm*300mm)

流动相：50mM乙酸铵水溶液，含20％甲醇；

流速：0.2mL/min，等度洗脱；

质谱条件：

Capillary：-2.3kV；Sampling Cone：10；Source offset：80；Source120℃；Desolvation 400℃；

Cone Gas：20I/h；Desolvation gas：600L/h。

1.2肝素酶I、II、III混合酶降解，通过强阴离子交换色谱分析二糖谱

肝素酶I、II、III完全酶解步骤：

20μl样品+70μl乙酸钙溶液(pH＝7.0)+100μl肝素酶I、II、III混合溶液(pH 7.0磷酸二氢钠溶液溶解)，混匀，置于25℃水浴中反应48h，灭活，过滤后进样。

酶解后液相分析条件：

色谱柱：Waters Spherisorb S5 SAX(4.0*250mm)