[发明专利]一种菌核病抗性基因鉴定方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种菌核病抗性基因鉴定方法。本发明构建待测基因的重组载体pCAMBIA‑35S‑X‑Nos，重组载体转入农杆菌后将待测基因快速转化到烟草叶片中，通过待测基因在烟草中的瞬时表达进行菌核病抗性基因的判定，从而快速鉴定出待测基因是否是菌核病抗性基因；本发明所述的菌核病抗性基因鉴定方法操作简单，不需要进行作物转化，可以有效缩短抗性鉴定时间，操作简单，可以实现快速筛选菌核病抗性基因，为获得抗菌核病优质基因资源提供了经济、简便、快速的有效解决办法。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种菌核病抗性基因鉴定方法。

背景技术

菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerorum）等真菌引起的植物病害，它可以侵染75科278属的408种植物，几乎可以危害全部双子叶植物和一些单子叶植物，主要危害的农作物有油菜、白菜、大豆、土豆、南瓜、花生、向日葵、芹菜、豌豆、胡萝卜、干豆、莴苣、黄瓜、菊芋和洋葱等。菌核病是一种破坏性极强的病害，在农业上每年造成巨大的损失。如在油菜生产中，菌核病每年全国发病面积在7000万亩以上，造成产量损失10%到20%，严重的情况可造成损失最高达80%。

菌核病的防治非常困难，现在采用的方法主要为化学防治或培育种植抗病品种。化学防治存在防效不高、病原难以根除、花期喷药困难以及农药残留、环境污染等诸多问题；常规育种具有难以找到有效的抗性材料以及育种速度非常缓慢等缺点，也很难有效解决抗病问题。随着分子生物学技术的发展，利用现代分子生物学技术发现和鉴定菌核病抗性基因，对抗菌核病作物品种的进行分子改良，快速培育抗菌核病品种，将是防治菌核病的重要策略。可见，菌核病抗性基因的鉴定是抗菌核病作物品种分子改良的重要基础。

然而，由于农作物生产周期长和普遍难以转化，现有的菌核病抗性基因的鉴定方法费时费力，而且对技术人员的专业化要求很高。以油菜为例，从载体构建到基因的转化，到转化株的筛选，然后直至抗病检测至少需要2年的时间。使得菌核病抗性基因的鉴定具有很大的局限性。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种可以快速、简便、低成本对菌核病抗性基因进行鉴定的方法。

发明人发现构建待测基因的表达载体，将表达载体转入农杆菌后转入烟草叶片中将待测基因快速转化到烟草，通过待测基因在烟草中的瞬时表达进行菌核病抗性基因的判定，能够实现菌核病抗性基因的筛选进程。目前尚未有相关的报道。因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种菌核病抗性基因鉴定方法，根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：

（1）在表达载体pCAMBIA的上游KpnI酶切位点处加入CaMV35S强启动子，下游BamHI酶切位点处加上CaMVNos终止子，构建载体pCAMBIA-35S-Nos，将待测基因X的片段连接入载体pCAMBIA-35S-Nos，构建得到待测基因X的重组载体pCAMBIA-35S-X-Nos；

（2）重组载体转化农杆菌的感受态细胞，在含有抗生素的培养基中培养得到重组菌悬液，转入空载质粒的空白菌株得到空载菌悬液作为空白对照；

（3）将步骤（2）中得到的重组菌悬液和空载菌悬液转入烟草叶片中，继续培养烟草植株；

（4）将核盘菌菌丝体接种在步骤（3）中转入菌悬液的烟草叶片上，暗培养后统计叶片发病情况，鉴定待测基因是否为抗性基因。

所述鉴定待测基因是否为抗性基因为当转入重组菌悬液的烟草叶片上病斑面积明显小于转入空白菌悬液的叶片时说明待测基因为菌核病抗性基因。

优选地，步骤（2）中所述的感受态细胞为农杆菌GV3101感受态细胞。