[发明专利]肌红蛋白的纯化方法及应用

说明书

本发明提供了一种肌红蛋白的纯化方法及应用，包括将含有肌红蛋白的待纯化样品依次经粗级分离、疏水层析纯化和镍柱纯化，达到对肌红蛋白的高效稳定纯化，使纯化得到的肌红蛋白的纯度达99％；纯化后所获得重组人肌红蛋白的活性、稳定性、特异性等性能均满足需求。

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，尤其是涉及一种肌红蛋白的纯化方法及应用。

背景技术

肌红蛋白(MYO)是一种含血色素的蛋白质，存在于动物的瘦肉组织中，心肌及横纹肌中含量较高，起储氧和携氧作用。在心肌梗死、肌肉损伤、药物中毒的情况下，肌细胞损坏而释放出肌红蛋白，由于肌红蛋白分子量较小(17KDa)且不与血浆蛋白质中珠蛋白结合，所以肌红蛋白一旦进入血液就容易从尿中排除，引起肌红蛋白尿。所以测定尿中或血中MYO含量是心肌梗死的一种早期诊断指标，测定肌红蛋白并区别血红蛋白及血液中其他蛋白质的方法有很多，但是灵敏度最高、特异性最强的方法就是用MYO特异性抗体测定机体MYO抗原的免疫学方法，因为肌红蛋白检测水平较高(ng/ml)，因此需要提纯MYO抗原免疫实验动物获得高纯度特异性的抗体。抗原提纯可从动物组织中天然提取，但是动物组织中杂蛋白含量较多，对提取条件要求较高，样本来源又受限制，且不利于控制样品批间差异，难度较大，不利于规模生产。目前，虽然通过多种途径可以很好地解决目的蛋白的高效表达，但后续肌红蛋白的高纯度及稳定纯化依然是个难题，尤其是需求满足免疫原对蛋白纯度的要求。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种肌红蛋白的纯化方法，以缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供上述肌红蛋白的纯化方法的应用。

本发明提供了一种肌红蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括将含有肌红蛋白的待纯化样品依次经粗级分离、疏水层析纯化和镍柱纯化，得到肌红蛋白。

进一步地，所述待纯化样品中的肌红蛋白为重组肌红蛋白；

优选地，所述重组肌红蛋白带有His标签。

进一步地，所述粗级分离的方法包括沉淀法；

优选地，所述沉淀法包括硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、丙酮沉淀法、苦味酸沉淀法、磷钨酸盐沉淀法或三氯乙酸沉淀法，优选为硫酸铵沉淀法；

优选地，所述硫酸铵沉淀法中硫酸铵溶液的浓度为35wt％-50wt％。

进一步地，所述疏水层析纯化中的疏水配基包括苯基、丁基或辛基，优选为苯基。

进一步地，所述疏水层析纯化依次包括步骤：平衡、洗杂和洗脱；

优选地，疏水层析洗脱步骤的电导为150-169ms/cm，优选为155-165ms/cm；

优选地，疏水层析洗杂步骤的电导为170-185ms/cm，优选为175-180ms/cm；

优选地，疏水层析平衡步骤的电导为190-250ms/cm，优选为200-240ms/cm。

进一步地，疏水层析洗脱步骤、疏水层析洗杂步骤或疏水层析平衡步骤中所用试剂的至少一种包括缓冲体系和盐；

优选地，所述缓冲体系包括PB、Tris-HCl、HEPES、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液；

优选地，所述盐选自硫酸铵、氯化钠、醋酸钠、磷酸二氢钾或柠檬酸钠。

进一步地，所述镍柱纯化依次包括步骤：平衡、洗杂和洗脱；

优选地，镍柱纯化洗脱步骤中所用试剂包括终浓度为50-100mM的咪唑，优选为55-80mM；