[发明专利]一种基于dSviCas3的基因转录调控方法在审
| 申请号： | 201910421000.1 | 申请日： | 2019-05-13 |
| 公开（公告）号： | CN110438143A | 公开（公告）日： | 2019-11-12 |
| 发明（设计）人： | 童望宇;李梅莉 | 申请（专利权）人： | 安徽大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/77;C12N15/81;C12N15/90;C12N9/22;C12R1/19;C12R1/15;C12R1/865 |
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| 地址： | 230601 安徽省*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因转录调控 转录调控 生物细胞 基因组 生物领域 序列切割 基因 对靶 构建 突变 优化 | ||
1.一种基于dSviCas3的基因转录调控方法，其特征在于：维吉尼亚链霉菌IBL14基因组中含有1个I-B-Svi型CRISPR-Cas系统，原始SviCas3因氨基酸序列改变而导致核酸内切酶活性缺失的工程蛋白dSviCas3(defective SviCas3)(蛋白序列见附表)结合含有与目标基因特定序列互补的靶向DNA(guide-DNA/g-DNA)或模板DNA(template DNA/t-DNA)可对生物体基因组中的基因转录进行有效调控。
2.根据权利要求1所述的一种基于dSviCas3的基因转录调控方法，其特征在于：
(1)调控载体的构建
根据dSviCas3氨基酸序列，化学合成相应细胞的碱基优化的基因dSvicas3；结合t-DNA、g-DNA和表达载体DNA序列设计并合成引物；通过PCR扩增及连接酶分别将dSvicas3和t-DNA/g-DNA与表达载体连接(或全化学合成)得到表达蛋白的调控载体Vectori-dSvicas3-t/g-DNA。
(2)基因转录调控转化子的获取与检验
通过化转、转染或电转化的方法，将按步骤(1)得到的蛋白表达调控载体Vectori-dSvicas3-g-DNA导入生物细胞中，选择培养得到候选的基因转录调控转化子；对候选转化子进行功能鉴定、靶序列PCR及测序分析，得到正确的基因转录调控转化子。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于dSviCas3的基因转录调控方法，其特征在于：所述的氨基酸序列改变而导致核酸内切酶活性缺失的工程蛋白dSviCas3指原始SviCas3氨基酸序列的添加、缺失或替换而丧失对靶DNA序列切割功能的蛋白质(与SviCas3具有50％以上的氨基酸序列一致性)。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于dSviCas3的基因转录调控方法，其特征在于：所述的合成相应细胞的碱基优化的dSvicas3序列指根据dSviCas3氨基酸序列而优化的适合于在不同细胞中表达的DNA序列。
5.根据权利要求1或2所述的一种基于dSviCas3的基因转录调控方法，其特征在于：所述的基因转录调控转化子指因基因转录水平的调控而导致靶蛋白表达水平的上调、下调或不表达，进而宿主细胞的表观、功能及生理发生变化的转化子。
6.根据权利要求1或2所述的一种基于dSviCas3的基因转录调控方法，其特征在于：所述的生物体指原核及真核生物中的任何一种，如：大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、人胚肾细胞等。
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