[发明专利]一种基于无脊椎动物重组铁蛋白的抗肿瘤纳米砷球的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于无脊椎动物重组铁蛋白的抗肿瘤纳米砷球的制备方法及其应用，特点是包括以下步骤：（1）依次通过基因扩增、原核表达载体的构建和原核表达以及蛋白纯化获得基于无脊椎动物重组铁蛋白；（2）将基于无脊椎动物重组铁蛋白置于透析袋中，在5 mM亚砷酸钠溶液中进行透析，整个富集过程中使用磁力搅拌器模拟流动液体，透析12 h后，将透析袋置于蛋白缓冲液中透析12 h，期间每隔4 h更换一次蛋白缓冲液，取出透析袋中的蛋白溶液经浓缩后，得到基于无脊椎动物重组铁蛋白的抗肿瘤纳米砷球，优点是对慢性粒细胞白血细胞K562细胞的增殖具有显著抑制作用。

技术领域

本发明涉及一种利用重组铁蛋白制备重金属纳米球，尤其是涉及一种基于无脊椎动物重组铁蛋白的抗肿瘤纳米砷球的制备方法及其应用。

背景技术

星虫、纽虫、泥蚶、缢蛏、仿刺参和海地瓜是经济无脊椎动物的代表。它们是典型的底栖生物，能耐受环境中较高浓度的重金属，这一特性与其体内铁蛋白对重金属的富集功能密不可分。因此，研究这些无脊椎动物富集重金属的生物功能，为在生物医学和材料化学以及生物纳米技术等领域的应用提供了可能性。近年来，已有利用铁蛋白进行靶向给药。

慢性粒细胞白血病是一种起源于造血干细胞的恶性肿瘤，常伴有白细胞异常增生及分化成熟障碍，其发病率和死亡率在儿童和青少年的恶性肿瘤中位居首位。该疾病的生物学特征是造血细胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡过程发生障碍、异常分化的细胞大量增殖。目前临床上常用的白血病细胞分化诱导剂有砷剂、维甲酸及其衍生物等。砷剂是人类历史上最早被用于肿瘤治疗的药物之一，但由于其毒副作用明显，砷剂在抗肿瘤上的应用也逐渐被人们放弃。20世纪70年代，我国学者张亭栋团队采用现代科学的给药方式，以砒霜（As₂O₃）为主要成分制成“癌灵”注射液，对急性粒细胞性白血病的治疗取得开创性成果。亚砷酸钠作为一种无机砷剂，其能通过诱导慢性粒细胞白血病细胞凋亡而抑制其增殖。但由于低剂量的砷剂治疗效果不够理想，而较高的剂量对正常细胞有较大毒副作用，会引起死亡。为了发挥亚砷酸钠治疗白血病的效果减少毒副作用，本发明基于无脊椎动物重组铁蛋白富集重金属的特性，将亚砷酸钠制成纳米砷球用于治疗白血病。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对慢性粒细胞白血细胞K562细胞的增殖具有显著抑制作用的基于无脊椎动物重组铁蛋白的抗肿瘤纳米砷球的制备方法及其应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于无脊椎动物重组铁蛋白的抗肿瘤纳米砷球的制备方法，包括以下步骤：

（1）基于无脊椎动物重组铁蛋白的制备

A．铁蛋白基因序列的克隆

a．多个砷结合位点的基因扩增

以Fer147基因序列作为模板，该基因序列为SEQID NO.1所示的cDNA序列，设计上游扩增引物FER-F：5′- CCGCTCGAGAATTAGGAGGAAGTCCAAGA-3′；和下游扩增引物FER-R：5′-CGCCATATGTCGGACTCAGAAGTCAATCA-3′，PCR扩增Fer147目的基因，利用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收和纯化，得到Fer147目的基因；

b．原核表达载体的构建

利用Nde I和Xho I两种限制性内切酶分别对Fer147目的基因和pET-28a(+)表达载体进行酶切，然后利用胶回收试剂盒分别对酶切产物进行回收纯化；利用DNA连接酶将酶切后的Fer147目的基因片段与pET-28a(+)空载质粒进行连接后，转化到感受态细胞DH5α中，经平板筛选PCR扩增及测序比对后，得到含有目的基因的阳性克隆子菌落，扩大培养后，利用质粒提取试剂盒提取质粒，得到含有Fer147的重组表达载体；所得重组表达载体转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，经平板筛选PCR扩增，得到含有目的基因的大肠杆菌BL21表达菌株；

c．原核表达