[发明专利]沙蚕精液胞浆素及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种沙蚕精液胞浆素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取沙蚕精液，低温离心，获得上清液；

向所得上清液中加入氯化钠解离，超滤，硫酸铵分级盐析沉淀；

氯化钠解离时使所得上清液中氯化钠浓度达到3.0%-4.0%；解离时间为2.0-3.0h；

所述超滤选用膜截留分子量为20-40kD的滤膜；进一步将超滤液用截留分子量为1-5kD的滤膜进行浓缩；

所述硫酸铵分级盐析沉淀为先向所得超滤液中加入硫酸铵，使其浓度达到25%-30%，盐析，去除沉淀；保留上清液，继续加入硫酸铵，使其浓度达到40%-50%，盐析，收集沉淀，得粗提物；

将所得粗提物采用pH为8.5-9.0的14%-16%PEG1000和16%-18%磷酸钾组成的双水相体系进行高速逆流色谱法分离；在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的活性组分添加硫酸铵盐析，收集沉淀，冷冻干燥，获得沙蚕精液胞浆素。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）选取生理阶段为性成熟的雄性沙蚕成虫进行饥饿处理后，消毒；

2）向清洁海水中添加消毒后的雄性沙蚕，然后添加少量的性成熟的雌性沙蚕匀浆离心上清液，收集沙蚕精液，低温离心，获得上清液；

3）搅拌条件下向步骤2）所得上清液加入氯化钠使其浓度达到3.0%-4.0%，解离；用膜截留分子量为20-40kD的滤膜超滤，收集超滤液；然后进一步用截留分子量为1-5kD的滤膜进行浓缩，得浓缩液；

4）向步骤3）所得浓缩液中加入硫酸铵，使其浓度达到25%-30%，盐析，去除沉淀；保留上清液，继续加入硫酸铵，使其浓度达到40%-50%，盐析，收集沉淀，得粗提物；

5）采用pH为8.5-9.0的14%-16%PEG1000和16%-18%磷酸钾组成的双水相体系，将所得粗提物采用高速逆流色谱法分离，在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的活性组分，添加硫酸铵盐析，收集沉淀，冷冻干燥，获得沙蚕精液胞浆素。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）预处理：取鲜活性成熟沙蚕雄虫，置于清洁流动海水中饥饿培养10-12h；然后置于清洁海水中，充入臭氧使海水中臭氧浓度为0.3-0.4mg/L，消毒10-15min；

2）沙蚕精液释放：在遮光的环境中，将经过预处理后的雄性沙蚕置于清洁海水中，添加性成熟的雌性沙蚕匀浆的上清液，促进雄性沙蚕释放精液，4-6h后收集沙蚕精液，低温离心除去沉淀，收集上清液；

3）解离及超滤处理：搅拌条件下向步骤2）所得上清液加入氯化钠使其浓度达到3.0%-4.0%，搅拌2.0-3.0h，解离；用膜截留分子量为20-40kD的滤膜超滤，收集超滤液；然后进一步用截留分子量为1-5kD的滤膜进行浓缩，得浓缩液；

4）分级沉淀：向步骤3）所得浓缩液中加入预冷的饱和硫酸铵溶液，使其浓度达到25%-30%，低温静置8-10h，盐析，低温离心去除沉淀；保留上清液，继续加入预冷的饱和硫酸铵溶液硫酸铵，使其浓度达到40%-50%，低温静置8-10h，盐析，收集沉淀，得粗提物；

5）高速逆流色谱分离：采用pH为8.5-9.0的14%-16%PEG1000和16%-18%磷酸钾双水相体系进行分离精液胞浆素，以上相为固定相，下相为流动相，控制流速为1.5-2.5ml/min，转速为800-900r/min，在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的活性组分，浓缩后添加硫酸铵至浓度为40-45%，低温静置8-10h，低温离心收集沉淀，冷冻干燥，获得沙蚕精液胞浆素。

4.权利要求1-3任一项所述方法制备的沙蚕精液胞浆素。

5.权利要求4所述沙蚕精液胞浆素在制药方面的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，是在制备具有抑菌作用的药物方面的用途。