[发明专利]一种共表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP4和VP35的重组杆状病毒的制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体公开了，一种共表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP4和VP35的重组杆状病毒的制备方法和应用。将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2所示序列顺序插入到pFastBac^TMⅠ的BamHⅠ和EcoR I酶切位点之间，得到重组质粒pFastBac‑S11‑T2A‑S6，最终获得可表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP4和VP35的重组杆状病毒，该重组病毒表达量高，制备的蛋白适合用于草鱼呼肠孤病毒病疫苗的生产，具备广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种共表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP4和VP35的重组杆状病毒的制备方法和应用。

技术背景

草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒引起的严重危害草鱼养殖的一种病毒性传染病，主要引起患病草鱼各器官、组织不同程度出血，内脏组织坏死，死亡率极高，对我国水产养殖带来巨大危害和经济损失。当前国内主要针对基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒开展研究，而对于基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的研究较少。根据全国主要草鱼养殖区流行病学调查结果表明，Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒是我国目前的主要流行株。草鱼呼肠孤病毒隶属于呼肠孤病毒科，水生呼肠孤病毒属，病毒粒子呈二十面体对称的球形体，成熟病毒直径为70-80nm，具有双层衣壳，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成，共编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。

基于生物信息学分析和前人研究结果，Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒S6节段编码的VP4蛋白和S11节段编码的VP35蛋白为该病毒的外衣壳蛋白，外衣壳蛋白在病毒进入细胞的过程中起着重要作用，并且能诱导宿主产生免疫应答，具有重要的免疫原性。因此，建立能够高效表达Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的表达系统对于草鱼呼肠孤病毒疫苗的研发及草鱼出血病的有效防治具有重要意义。多基因表达载体的优势在于可同时表达2个或多个基因，但早期常用的多基因表达载体多存在容量小，易出现上、下游基因表达失衡，蛋白活性低或所表达蛋白不能精确定位等缺陷。近年，一种名为自剪切2A肽的多基因载体构建策略受到广泛关注。2A肽是首先在小核糖核酸病毒中发现的一种具有“自剪切”功能的肽链。报道称，2A肽剪切反应发生在翻译阶段的核糖体肽基转移酶中心，其剪切功能不是通过蛋白酶水解作用，而是经核糖体“跳跃”来实现的，发生在C末端Gly-Pro残基之间。研究认为2A肽改变了核糖体的活性，促进2A肽残基Gly与tRNAGly之间酯链的水解，从转录复合物上释放上游多肽的同时又推进下游蛋白的翻译。此过程被认为是核糖体从一个密码子跳跃至下一个密码子而中间没有肽键形成。其功能主要是能够将上下游2个蛋白实现单独翻译。2A肽介导的多基因表达载体具有高裂解活性且上、下游基因等摩尔表达等优点，其剪切效率约为90％，具备明显的优势，是目前较为理想的多基因表达策略，已广泛应用于动物转基因研究。目前大量研究表明该剪切功能只在真核表达系统中发挥，原核表达系统内无此剪切功能。不同的2A肽剪切效率不一致，有可能存在剪切不完全的现象。2A肽上游序列会影响剪切效率。

草鱼呼肠孤病毒作为中国分离的第一种鱼类病毒，尚无利用该种自剪切肽在同一真核表达载体中同时表达两个抗原性蛋白的报道。