[发明专利]卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用，卵母细胞体外成熟培养液包括发情母犬血清、发情母犬卵泡液和基础培养液。该卵母细胞体外成熟培养液可使犬COCs体外核成熟至MI‑MII阶段的比例稳定在45％左右，显著提高了犬COCs体外核成熟率，为犬卵母细胞体外成熟培养提供了新的思路。

技术领域

本发明涉及卵母细胞体外培养技术领域，特别是涉及一种卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用。

背景技术

犬科动物如比格犬(Beagle)，品种固定且优良，遗传性能稳定、重复性好，对环境的适应力、抗病力较强，性格温顺，被公认为理想的实验动物，广泛应用于医药研究等生物学领域，尤其在新药安全评价与研发领域是世界公认的首选用犬。但由于犬科动物生殖生理的特殊性，其卵母细胞的体外培养成熟率低，辅助生殖研究进展缓慢，严重制约了该类动物在生物科学研究中的运用。犬科动物为非季节性单次发情动物，一年发情1～2次，犬发情间期平均180天，母犬排卵虽然主要集中在发情期前1～3日内，但在发情期的7日内随时都可发生排卵，发情排卵鉴定是仍是技术瓶颈之一。且与牛、羊等直接排出成熟的卵母细胞不同，犬排出的卵母细胞处于生发泡期(Germinal vesicle,GV)，需进一步在输卵管内完成成熟过程(48h～72h)才具备受精能力，因此犬卵母细胞体外成熟所需的条件不同于其他哺乳动物。尤其目前犬促排卵技术效果不明显，如果通过手术从自然发情排卵的母犬上获取成熟卵母细胞，需要耗费大量的人力物力，因此大多数科研工作者希望从犬卵巢收集卵丘卵母细胞复合体(COCs)再进行体外成熟来获得成熟犬卵母细胞，以进行后续研究，例如种子体外冷冻保存及基因编辑疾病模型犬的制备等。

自1976年第一次报道犬科动物卵母细胞体外成熟培养至今，犬卵母细胞体外成熟率仍远远滞后于鼠、牛、猪、羊等其它哺乳动物，目前国内外在犬卵母细胞体外成熟培养上仍处于探索阶段，进展缓慢。国内外报道的犬COCs体外培养，大概60％的COCs取出后就停止发育，大概25％的卵母细胞退化，只有20％左右能成功发育至MII阶段。近年来基因编辑技术进展很快，我国也已成功实现世界首例基因敲除犬，但该技术及体外保种要求有充足的实验材料即受精卵，因此急切需要解决犬COCs体外核成熟的技术壁垒，使成熟卵母细胞的获得变得更加简单、方便，以尽快应用于保种及基因编辑疾病模型犬研究。

发明内容

基于此，有必要提供一种用于犬卵丘卵母细胞复合体体外培养的能够提高成熟率的卵母细胞体外成熟培养液。

一种卵母细胞体外成熟培养液，包括发情母犬血清、发情母犬卵泡液和基础培养液。

由于在犬科动物体内，排卵前卵母细胞处于卵泡环境中，生发泡期卵母细胞排到输卵管内，并在此恢复和完成减数分裂，因此，四十多年来科研人员一直致力于在体外模拟输卵管内环境对COCs进行培养，例如往培养液添加促性腺激素(FSH、LH、PMSG、HCG)、甾类(E2、P4)、生长因子(IGF-1、EGF)、各种蛋白源、透明质酸酶、抗氧化剂和细胞周期抑制剂等，以及与犬输卵管上皮细胞共培养，或者将卵母细胞注入体外培养的输卵管内，但效果均不是太理想。而本发明的发明人针对目前犬COCs体外培养核成熟率低且培养液配方较复杂的问题，对犬COCs体外成熟培养液配方进行了大量尝试，建立了一种新的用于犬COCs体外核成熟的卵母细胞体外成熟培养液，首次在培养液中添加发情母犬卵泡液及血清，且无须额外添加激素、生长因子等，培养液配方简单易行。本发明的卵母细胞体外成熟培养液可使犬COCs体外核成熟率(MI-MII期)稳定在45％左右，显著提高了犬COCs体外核成熟率，达到世界先进水平，为犬卵母细胞体外成熟培养提供了新的思路。

在其中一个实施例中，在所述卵母细胞体外成熟培养液中，所述发情母犬血清的体积百分比为20％～55％，所述发情母犬卵泡液的体积百分比为8％～40％。

在其中一个实施例中，在所述卵母细胞体外成熟培养液中，所述发情母犬血清的体积百分比为48％～52％，所述发情母犬卵泡液的体积百分比为8％～12％。