[发明专利]准确鉴别插入突变纯、杂合线虫的三引物组及PCR鉴别方法

权利要求书

1.准确鉴别插入突变纯、杂合线虫的三引物组，其特征在于，所述三引物组由上游引物WT-S、下游引物WT-A和第三引物I-S组成。

2.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述上游引物WT-S设置在所述插入突变的5’上游200bp-700bp位置，所述下游引物WT-A设置在所述插入突变的3’下游200bp-700bp位置，所述第三引物I-S设置在所述插入突变被插入的序列上。

3.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述上游引物WT-S与下游引物WT-A以及所述第三引物I-S与下游引物WT-A的G、C碱基百分比相差不超过10％，总碱基个数相差不超过2个碱基，且无引物间二聚体。

4.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述上游引物WT-S对和下游引物WT-A组成第一引物对，第三引物I-S和下游引物D-A组成第二引物对，所述第一引物对和第二引物对的退火温度相同。

5.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述第一引物对扩增野生型模板DNA后得到的片段大小为600-1200bp，所述第二引物对扩增插入突变模板DNA后得到的片段大小为600-1200bp。

6.根据权利要求5所述的三引物组，其特征在于，所述第二引物对扩增插入突变模板DNA后得到的片段比第一引物对扩增野生型模板DNA后得到的片段长100bp-350bp。

7.三引物组用于插入突变纯、杂合线虫的PCR鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

引物设计：利用引物设计软件进行三引物设计，所述三引物为权利要求1-6中任一项所述的上游引物WT-S、下游引物WT-A和第三引物I-S，且所述上游引物WT-S和下游引物WT-A组成第一引物对，所述第三引物I-S和下游引物WT-A组成第二引物对；

获取需要鉴定的线虫DNA模板；

确定最适退火温度：以野生型线虫为模板，分别使用所述第一引物对和第二引物对，进行温度梯度PCR，寻找两个引物对都能PCR扩增出条带正确且亮度合适的退火温度；

三引物组PCR：将所述上游引物WT-S、下游引物WT-A和第三引物I-S同时加入PCR混合液中，作用于需要鉴定的线虫DNA模板进行竞争性PCR，得到PCR产物；

将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析谱图，得出结果。

8.根据权利要求7所述的PCR鉴别方法，其特征在于，所述三引物组PCR步骤中用的PCR体系为：

10xpfu扩增缓冲液，1μL；

浓度为10mM的dNTP，0.2μL；

Pfu高保真酶，0.5μL；

浓度为100μM的所述上游引物WT-S，0.05μL；

浓度为100μM的所述下游引物WT-A，0.05μL；

浓度为100μM的所述第三引物I-S，0.05μL；

需要鉴定的线虫DNA模板，0.5μL；

重蒸馏水，7.65μL。

9.根据权利要求8所述的PCR鉴别方法，其特征在于，将所述三引物组PCR步骤的工艺条件为：

94℃1min30s；

94℃20s；最适退火温度20s；72℃1min，以上三个步骤30个循环；

72℃5min；

18℃保存。