[发明专利]一种目的基因转化原生质体的方法在审
| 申请号： | 201910010502.5 | 申请日： | 2019-01-07 |
| 公开（公告）号： | CN109554329A | 公开（公告）日： | 2019-04-02 |
| 发明（设计）人： | 李青竹;许俊旭;张永春;杨柳燕;孙翊;李心;王桢;周晓慧;杨贞 | 申请（专利权）人： | 上海市农业科学院 |
| 主分类号： | C12N5/04 | 分类号： | C12N5/04;C12N15/82 |
| 代理公司： | 上海容慧专利代理事务所(普通合伙) 31287 | 代理人： | 张竹梅 |
| 地址： | 201106 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 原生质体 目的基因 原生质体提取 原材料处理 候选基因 技术支持 遗传转化 种质利用 可用 转化 生物工程 改良 应用 分析 | ||
1.一种原生质体的提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)原材料处理：将石蒜科植物幼苗，黑暗处理10-12h后，将幼苗叶片切为碎片；
(2)酶解释放原生质体：将步骤(1)中得到的碎片放入试剂A中，温度22-28℃，震荡处理1-6h，得到混合溶液；
(3)原生质体的纯化：将步骤(2)获得的混合溶液用40-50μm滤网进行过滤，收集滤液，滤液离心5-10min，离心温度为4℃，收集沉淀；沉淀用试剂B清洗、离心，最后离心沉淀用试剂C悬浮，得到原生质体悬浮液；
其中所述的试剂A为：Cellulase R10：0.05-0.5g、Macerozyme R10：0.01-0.5g、Mannitol：1-10g、MES：0.01-1.0g、CaCl2：0.01-1.0g、H2O：补足20ml体积；
试剂B为：NaCl：0.45-4.5g、CaCl2：0.5-6.0g、KCl：0.01-1.0g、MES：0.02-2.0g、H2O：补足100ml体积；
试剂C为：Mannitol：0.5-5.0g、MgCl2·6H2O：0.01-1.0g、MES：0.001-0.1g、H2O：补足10ml体积。
2.权利要求1所述提取方法得到的原生质体。
3.一种目的基因转化权利要求2所述原生质体的方法，其特征在于该方法为：
在原生质体悬浮液中，依次加入目的基因质粒载体和试剂D，室温暗培养10-30min后，实现目的基因的转化；
其中试剂D为：PEG4000：0.1-0.5g、Mannitol：0.01-0.15g、CaCl2：0.0012-0.12g、H2O：补足1ml体积。
4.一种目的基因转化原生质体的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)原材料处理：将石蒜科植物幼苗，黑暗处理10-12h后，将幼苗叶片切为碎片；
(2)酶解释放原生质体：将步骤(1)中得到的碎片放入试剂A中，温度22-28℃，震荡处理1-6h，得到混合溶液；
(3)原生质体的纯化：将步骤(2)获得的混合溶液用40-50μm滤网进行过滤，收集滤液，滤液离心5-10min，离心温度为4℃，收集沉淀；沉淀用试剂B清洗、离心，最后离心沉淀用试剂C悬浮，得到原生质体悬浮液；
(4)目的基因的转化：取步骤(3)获得的原生质体悬浮液，依次加入目的基因质粒载体和试剂D，室温暗培养10-30min后，实现目的基因的转化；
其中所述的试剂A为：Cellulase R10：0.05-0.5g、Macerozyme R10：0.01-0.5g、Mannitol：1-10g、MES：0.01-1.0g、CaCl2：0.01-1.0g、H2O：补足20ml体积；
试剂B为：NaCl：0.45-4.5g、CaCl2：0.5-6.0g、KCl：0.01-1.0g、MES：0.02-2.0g、H2O：补足100ml体积；
试剂C为：Mannitol：0.5-5.0g、MgCl2·6H2O：0.01-1.0g、MES：0.001-0.1g、H2O：补足10ml体积；
试剂D为：PEG4000：0.1-0.5g、Mannitol：0.01-0.15g、CaCl2：0.0012-0.12g、H2O：补足1ml体积。
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