[发明专利]一种常温或高温下花粉活性快速定量的方法及应用

说明书

本发明属于植物生理生化技术应用领域。具体涉及一种常温或高温下花粉活性快速定量的方法及应用。确定了常温和高温下花粉TTC染色液的配方、染色浓度和最适染色时间和适用范围，制备了组合染色溶液配方：1mol/L磷酸二氢钾5.23g，磷酸氢二钾14.03g，pH为7的磷酸钾缓冲液；再将8g的2,3,5‑三苯基氯化四氮唑(TTC)溶于所得的磷酸钾缓冲液中，用蒸馏水定容至1L，使其终浓度为8g/L。本发明可用于对大批量材料进行花粉活性定量检测，省略了染色后的镜检操作，简化了大批量材料花粉活性鉴定的流程，适用于棉花，水稻等多种作物花粉活性鉴定。

技术领域

本发明属于植物生理生化技术应用领域。具体涉及一种常温或高温下花粉活性快速定量的方法及应用所述的方法通过染色液染色并萃取，测定吸光度进行定量的方案进行。本发明一方面极大地简化了操作流程，另一方面还可以对花粉的活力进行精确定量。

背景技术

随着全球气候变暖，高温逆境已成为影响作物生产的主要因子之一。植物器官发育对环境温度的变化十分敏感，高温会导致生殖器官的发育异常。雄性生殖器官对于环境温度变化的敏感程度高于雌性生殖器官，特别是雄蕊，发育时期的极端温度都会导致雄蕊或雄配子(花粉)发育异常造成雄性不育。现有很多关于高温胁迫导致雄性不育的报道，如大麦、拟南芥、水稻和棉花，这其中由于花粉活性受到高温影响而败育的占绝大多数。花粉活性是决定植物雌性器官能否正常受精的关键因素之一，直接关系到植物能否产生种子或有活力的种子。

高温对花粉活性的影响随着胁迫的时间不同存在差别，在左丹丹等人的综述文章中，总结了现阶段常用的几种花粉活力染色方法，包括I₂-KI，荧光染料双染色法，酸性品红染色法等。这些检测方法的原理基本都是利用染剂，对花粉内的一系列活性内含物进行染色，进行显微镜镜检，再通过计数视野中可育花粉和不育花粉的数目进行进一步的育性和不育度确定。

还有一类检测方法是做花粉管萌发试验，将花粉管置于萌发培养基上，进行花粉管萌发诱导，通过计数萌发花粉数目和未萌发花粉的数目来鉴定不育度。

以上方法都存在一些缺点，如只能对活力进行定性不能进行定量，不能进行大批量的样品鉴定分析，计数受人为主观因素影响较大等。因此，开发一种简单的，精确的花粉活力定性与定量方案对于准确评估花粉活力具有重要作用。

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法是现在常用的花粉活性鉴定方法，TTC是一种氧化还原色素，溶于水时为无色溶液。TTC可以进入植物细胞，并被植物细胞内的脱氢酶还原产生不溶于水的三苯甲腙(TTF)，TTF在室温下很稳定，不易被氧化，同时对细胞的毒害很小，所以TTC经常作为植物组织、细胞，包括花粉活性鉴定的染色剂。

TTC进入花粉细胞之后，被脱氢酶还原后可以在花粉中产生TTF，且花粉内的TTF不会透过细胞膜进入染色剂中，所以可以将染色后的花粉在显微镜下进行镜检以对花粉的活性进行统计。有活性的花粉可以被染上红色，在显微镜下可以被轻易的辨别出来，但是每一个花粉的活性都是不一样的，产生TTF的能力也是不同的。在所被检测的花粉中，存在许多活性中等的花粉。在显微镜下，这样的花粉活性用人眼非常难辨别。同时，由于是镜检，无法确保选择视野中的花粉活性统计结果能准确代表该材料的花粉活性，并且对大批量的材料进行活性统计的时候会相当费时费力。由此衍生出较多的问题，导致TTC染色法在花粉活性鉴定中的广泛应用捉襟见肘。

本发明所述的TTC染色定量法是基于花粉TTC染色后镜检的方法而来。通过优化试验方案，本发明中使用的磷酸盐(优选为磷酸钾)缓冲液可以使TTC花粉染色在常温下进行，并进一步确定了最适的染色持续时间。同时本发明通过对比花粉定量和花药定量，明确了可通过花药活性定量精确评估花粉活性，这两种方法均可以满足大批量的花粉活性定性和定量检测。

发明内容

本发明目的在于克服现今各种染色法不能快速，大批量进行花粉活性鉴定的缺陷，将对花粉或者整个花药染色后萃取三苯甲腙(TTF)进行定量的方法来评估花粉活力，并将这种方法用于大批量的花粉活性鉴定，以简化定量操作流程，提高检测的精确度。