[发明专利]通过选择性等位基因富集或消耗用低深度测序检测和定量稀有变体

权利要求书

1.检测目的DNA区域内稀有序列变体的存在的方法，所述方法包括：

(a)用引物使用聚合酶链式反应(PCR)扩增一个或更多个目的区域，每种引物包含5’序列-衔接子区和3’基因特异性区，从而产生双链扩增子；

(b)使所述双链扩增子变性，从而产生单链扩增子；

(c)将所述单链扩增子与阴性选择沉降子的混合物杂交；

(d)去除与沉降子结合的单链扩增子；

(e)使用包含测序衔接子序列的引物通过PCR扩增剩余的单链扩增子；以及

(f)进行高通量DNA测序。

2.权利要求1所述的方法，其中所述稀有变体具有未知的序列身份。

3.权利要求1所述的方法，其中所述稀有变体具有已知的序列身份。

4.权利要求3所述的方法，其中步骤(c)还包括将所述单链扩增子与阳性选择探针的混合物杂交。

5.权利要求4所述的方法，其中所述探针包括立足点探针、微调探针或X-探针。

6.权利要求3或4所述的方法，其中所述探针和沉降子是热力学上竞争性的。

7.权利要求3至6中任一项所述的方法，其中对于每种稀有序列变体存在一个探针和一个沉降子。

8.权利要求3至6中任一项所述的方法，其中对于每种稀有序列变体存在一个探针。

9.权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述探针包含具有表1的配对的探针互补序列和探针保护物寡核苷酸的探针。

10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述沉降子包含具有表2的配对的沉降子互补序列和沉降子保护物寡核苷酸的沉降子。

11.权利要求3或4所述的方法，其中步骤(d)还包括收集与探针结合的扩增子。

12.权利要求11所述的方法，其中步骤(d)通过链霉亲和素包被的磁珠进行，使用磁体进行收集，并且步骤(c)中的探针用生物素直接官能化或与用生物素官能化的通用寡核苷酸杂交。

13.权利要求11所述的方法，其中步骤(d)通过链霉亲和素包被的琼脂糖珠进行，利用离心力进行收集，并且步骤(c)中的探针用生物素直接官能化或与用生物素官能化的通用寡核苷酸杂交。

14.权利要求11至13中任一项所述的方法，其中与沉降子结合的单链扩增子的去除通过收集与探针结合的扩增子而发生。

15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述杂交在约15℃至约75℃的温度下进行。

16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述杂交在一价阳离子浓度为约50mM至约5M的缓冲液中进行。

17.权利要求16所述的方法，其中所述一价阳离子是钠。

18.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述杂交在二价阳离子浓度为约3mM至约30mM的缓冲液中进行。

19.权利要求18所述的方法，其中所述二价阳离子是镁。

20.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中当扩增超过一个目的区域时，步骤(a)中的PCR是多重PCR。