[发明专利]一种EGFR基因的FISH探针的制备方法

说明书

本发明属于生物化学领域，具体属于生物化学相关的测定或检测领域；更具体涉及一种EGFR基因的FISH探针的制备方法，及由该方法制备出的探针。本发明提供的方法使用BAC克隆、酶切打断以及不对称扩增等方法制备探针文库，使得产品灵敏度、特异性以及信号强度均得到有效提高。

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体属于生物化学相关的测定或检测领域；更具体涉及一种EGFR基因的FISH探针的制备方法，及由该方法制备出的探针。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是细胞表面受体酪氨酸激酶HER/ErbB家族成员，广泛分布于人体多种正常组织的细胞膜上，对细胞的增殖、迁移起到重要的作用。EGFR分子量170KDa，位于细胞膜表面，属于酪氨酸激酶型受体。

EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，为以EGFR为靶向的肿瘤治疗和针对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。

目前对于EGFR基因异常的检测主要有两种方法，一种是基于聚合酶链式反应(PCR)的基因突变检测方法，一种是基于荧光原位杂交法(FISH)的基因扩增检测方法。

基于PCR的基因突变检测方法，例如：

中国专利申请201710153611.3公开了一种EGFR基因检测试剂盒及检测方法。该试剂盒针对EGFR18号外显子、19号外显子、20号外显子、21号外显子区域的特定位点，设计了特异性的扩增引物序列，使得对待测位点的检测假阳性率低，灵敏度高，能够检测出突变比例为5％以上的基因突变；在含待测位点的EGFR核酸片段两端分别F接头和R接头获得文库分子，F接头和R接头上均含有扩增引物结合位点，当对多个含待测位点的EGFR基因片段进行测序时，统一了对文库分子进行扩增的扩增引物，保证了扩增效率的一致性，降低了引物设计难度；R接头设计为发夹结构，能够对扩增产物的末端进行封闭，从而有效避免F接头连接在R接头上，提高了连接效率。

中国专利申请201810278490.X公开了一种直接使用TaqMan探针检测EGFR基因上热点突变的试剂盒，涉及到8个热点位点。每个位点对应于两条上下游引物及特异性的两条TaqMan探针，并且将8个SNP位点分为4组体系，于单管反应体系中同时对2个位点进行检测。该发明试剂盒采用四重探针检测技术，通过特异性扩增，于单个反应体系中检测出两个位点的信息。此试剂盒具有检测速度快、敏感性和特异性好的优点。

中国专利申请201310756037.2公开了一种无创检测受试者中EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：针对EGFR基因外显子设计引物；抽提受试者血浆DNA；将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接；将上述与标签接头连接的血浆DNA进行PCR预扩增；将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA；利用所述引物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析EGFR基因的突变。

以上检测方法主要针对EGFR的点突变进行检测。

基于FISH技术的检测方法，例如中国专利申请201510050952.9中公开了EGFR基因扩增检测探针、试剂盒以及方法，包括有标记荧光染料的、针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针。该申请所提供的EGFR基因扩增检测试剂盒中的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉反应，与染色体中EGFR目标检测片段进行识别杂交，具有准确性高，特异性好、及假阳性低的优点。

根据上述申请公开的内容不难看出，其采用的技术思路为：1、涉及扩增引物用于扩增探针并构建探针库(在此步骤中该申请采用常规T-A克隆方式直接对扩增产物进行建库，并未对扩增产物做任何其它处理)；2、将上述探针库标记后直接用于样本检测。