[发明专利]一种EGFR基因的FISH探针的制备方法

权利要求书

1.一种 EGFR 基因的 FISH 探针文库的制备方法，其特征在于：所述的制备 方法包括以下步骤：

(1)制备得到探针 1；

(2)酶切打断步骤(1)获得的探针 1，得到探针 2；

(3)给步骤(2)获得的探针 2 添加接头，得到探针 3；

(4)对步骤(3)获得的探针 3 进行不对称扩增，得到 FISH 探针文库； 所述的步骤(1)中的探针 1 为探针 1A 和探针 1B，所述的探针 1A 为针对 EGFR

的基因的一条探针；所述的探针 1B 为针对人类 7 号染色体着丝粒区域的一条探针；所述探针 1A 为 1ng/μL 的 BAC 克隆 RP11-443C12，所述的探针 1B 为 1ng/μL 的BAC 克隆 RP11-1146G20；

所述的步骤(2)中的酶切打断探针 1 使用的酶为限制性内切酶混合液，所述 的限制性内切酶混合液包括 AluI、HpyCH4V、MluCI 和 BfaI，且其体积比为 1:2:0.5:0.4；

所述的步骤(3)给探针 2 添加接头的方法为：通过 T4 DNA 连接酶将探针 2

和接头序列连接；

所述的接头序列为 A1 接头和 A2 接头，其中 A2 接头 5’端第一个碱基 C 含 有磷酸化修饰：

所述的 A1 接头的核苷酸序列为 SEQ ID NO：1 所示的序列：

5’-CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT-3’；

所述的 A2 接头的核苷酸序列为 SEQ ID NO：2 所示的序列：

5’-CCATCACATCTCTGAGTGTCTCCGA-3’；

所述的步骤(4)中对探针 3 进行不对称扩增，通过在扩增使用的 dNTP 中加入aminoallyl-dUTP 实现在 FISH 探针序列中掺入氨基标记的目的；

所述的不对称扩增体系包括：dNTP、aminoallyl-dUTP、Epimark Hot start TaqDNApolymerase、引物和探针 3；所述 dNTP 由 dATP，dCTP，dGTP 和 dTTP 混 合配制而成；

所述的 dNTP 和 aminoallyl-dUTP 的摩尔比为 4:1； 所述的 dTTP 和 aminoallyl-dUTP 的摩尔比为 1:4； 所述的引物为：

正向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO：3 所示的序列：

5’-CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT-3’；

负向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO：4 所示的序列：

5’-TCGGAGACACTCAGAGATGTGATGG-3’。

2.一种 EGFR 基因的 FISH 探针文库，其特征在于：所述的 FISH 探针文库 采用权利要求 1 所述的制备方法构建而成。

3.一种用于检测 EGFR 基因异常的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含 权利要求2 所述的探针文库。