[发明专利]人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法

说明书

本发明涉及基因检测技术领域，具体提供一种人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法。该试剂包括：分别针对β^IVSⅡ654、β^CD‑17、β^‑28、β^CD41‑42、β^CD‑71‑72、β^CD‑26基因位点的第一、第二、第三、第四、第五、第六对引物；第一、第二、第三、第四、第五、第六单位点探针。本发明的试剂检测结合率高、通量大而且检测成本低。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种人β地中海贫血基因分型检测的试剂和检测方法。

背景技术

由于编码组成血红蛋白(Hb)分子的α或β珠蛋白肽链基因缺失或基因突变(SNP)，导致α或β珠蛋白肽链生成减少或缺乏，从而形成珠蛋白生成障碍性贫血，即是地中海贫血。

其中，β地中海贫血是由于β珠蛋白肽链合成不足的结果。β基因突变类型繁多，已发现有170多种的β基因突变可导致本病。根据已有的文献报道的结果：β^IVSⅡ654、β^CD-17、β^-28、β^CD41-42、β^CD-71-72、β^CD-26这6个位点的基因突变类型在中国人群最为常见，占90％以上。有研究深圳市小儿α/β地中海贫血基因类型的文献得出，β地中海贫血中，以β^IVSⅡ654和β^CD41-42杂合子为主。

目前临床检验β地中海贫血基因突变的方法有两种：固相检测和均相检测。其中以固相检测的反向斑点杂交法为主流的方法，大部分医院的检验科均使用这种方法的试剂盒，代表的厂家有深圳益生堂生物企业，亚能生物技术(深圳)，凯普生物等。反向斑点杂交法在常规PCR扩增结束后，还需要转移PCR产物，用各自的杂交设备，进行PCR产物与固定在特定载体的特异性探针杂交，此方法虽然检测通量大，但是设备、试剂和时间成本高，且对PCR产物进行了转移，在一定程度上增加了实验室PCR产物气溶胶的风险。均相检测是不需要分离PCR产物直接在PCR仪进行PCR产物分析的方法，但是由于β地中海贫血的基因类型很多，均相检测通量小，所以已报道的均相检测β地中海贫血基因的非常少。

目前，均相检测中应用较突出的有厦门致善科技的改良的分子信标法，其检测通量大。用分子信标探针检测基因突变分型的原理是设计一条与靶序列产物匹配的探针，人工添加两端或其中一端的碱基，使探针在低温下两端形成发夹结构，3’端的淬灭剂淬灭5’端的荧光报告分子，随着温度的升高，茎结构被破坏，荧光报告分子与猝灭剂相互分离，荧光报告分子得以发射荧光。在探针与靶序列熔解的过程中，不同匹配度的靶序列的Tm值不同，从而可以达到SNP单碱基分辨的目的。但是分子信标探针设计难，其茎环结构容易使错配的靶序列结合效率低甚至结合不上，需要进行大量设计合成探针和实验验证才能选出合适的探针，且理论的Tm值与实际的Tm值区别大，不容易仅在设计层次就预测出合适的探针。

传统的用Taqman探针检测SNP分型的原理是指在同一PCR体系中，针对同一SNP的两个等位基因，分别设计两条与两种靶序列产物完全匹配的标记不同荧光的Taqman探针。随着PCR的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被Taq DNA聚合酶5′→3′外切酶活性切割，致使探针5′端上的荧光基团与3′端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告荧光基团被激活；而与模板不能完全配对的探针，表明另一对等位基因不能被有效切割，故检测不到荧光信号，通过相应仪器检测荧光值的变化即可实现SNP位点检测。传统的Taqman探针法设计探针较容易，选择合适的长度，合适的GC含量即可，不需要像分子信标那样在两端添加碱基，添加的碱基增加了不匹配度，导致错配的Target有与探针结合不了的风险。但是传统的Taqman探针检测通量小，对同一个SNP需要设计两条探针，荧光基团成本高，增加了检测的成本。

发明内容