[发明专利]根结线虫会阴花纹快速制片方法

说明书

本发明公开了一种根结线虫会阴花纹快速制片方法，包括以下步骤：(1)挑取并转移雌虫；(2)用11号解剖刀，一刀斜切切下带有雌虫尾部完整会阴花纹的五分之一至二分之一虫体，之后将带有会阴花纹的部分虫体转移到质量分数60％乳酸溶液中；(3)清理：将切口向下或向侧面，用昆虫针按压上述虫体表皮1～5次，虫体中的内容物会快速释放，10～60秒即可清理干净内容物；(4)用11号解剖刀沿花纹边缘切割，得到含有完整会阴花纹的小块表皮；(5)制作根结线虫会阴花纹永久玻片。本发明使用优化的下刀方式，能一刀切取会阴花纹部分，斜切得到的剖面面积大，在大块表皮上直接进行内容物清理，操作比便捷方便。本发明方法用间短，成功率高，表皮不易在清理时破坏。

技术领域

本发明涉及根结属线虫的会阴花纹永久玻片制作方法。

背景技术

随着全球经济一体化，国际贸易与日俱增，外来检疫性有害生物传入我国的风险日趋严重，我国已经成为世界上受外来检疫性有害生物威胁最为严重的国家之一。生物入侵由于其带来社会、经济和生态问题已经引起了世界各国政府的高度关注，这些入侵物种不仅严重威胁着生态系统，加速物种灭绝，而且还造成生物多样性的丧失。

目前，我国进境植物检疫性有害生物名录中共列入检疫性线虫20种(属)，其中根结属(非中国种)为检疫性线虫。根结属线虫种类最多、危害最大、入侵风险最高，Abad等估计全球农作物每年因根结属线虫危害造成的损失高达1570亿美元。目前全球已报道的根结属线虫约104种，其中约24种为中国种，80余种为非中国种。无论是口岸线虫检疫，还是国内线虫病害研究和防控，都要求对根结属线虫进行准确鉴定。长期以来，由于每种根结属线虫雌虫会阴花纹具有比较稳定的特征，其花纹整体形态、线纹粗细、背弓高度、侧线有无、侧尾腺间距等可用于种类鉴定。因此，根结线虫形态鉴定通常必须制作会阴花纹。

现有的根结线虫会阴花纹制片方法主要根据刘维志主编的《植物病原线虫学》(中国农业出版社2000年出版)，书中介绍了根结线虫雌虫会阴花纹的制片方法：

(一)会阴花纹的常规制作方法：

①选取被根结线虫危害的植物根部，用流水充分洗净根部土壤；

②在0.1％酸性品红乳酚油中浸泡根组织72h(本操作步骤可以忽略)；

③在体视显微镜下，用挑针、镊子或解剖刀等，从根部解剖出雌虫；

④将雌虫放在塑料培养皿玻片(或载破片，但易损伤解剖刀)一侧的水滴中，在体视显微镜下，用锋利的解剖刀按照图1B示切下第一刀；

⑤将切下后的雌虫后部角质膜移至玻片另一侧的45％乳酸中，按图1B切下第二、三刀；

⑥将剩余的后部角质膜移至另一洁净玻片上的45％乳酸中，用细毛笔轻轻剔除卵和其他黏附物；

注意：本步骤为关键，既要剔除干净附着物，不影响以后观察，又不能弄破角质膜。

⑦在乳酸浮载剂中用解剖刀修整后部角质膜小块，一般为长方形(图1C)，整理好的小块要包括会阴部分，也不过大为好；

⑧将合格的角质膜(图1D)若干块放在纯甘油内，用毛针整齐摆好位置，并压沉紧贴载玻片，加盖玻片，用封片剂封片，贴上标签。

该方法是现有通用的会阴花纹制片方法。其下刀方式如图1B所示，先横切一刀，再斜切一刀，最后反方向斜切一刀，得到包含会阴部位的小片角质膜，然后用细毛笔来剔除附着物。

从实验人员实际操作来看，该方法是先下刀切成小片，得到的小片角质膜在溶液中非常容易滑动，教材上说，步骤⑥清理附着物非常关键，可是实际应用中，用毛笔剔除小片角质膜上的附着物非常难操作，附着物难以剔除干净，如果为了剔除干净而用力清扫，就非常容易弄破角质膜。