[发明专利]一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法

说明书

本发明属于精子细胞处理技术领域，具体涉及一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其主要包括以下步骤：1)获得水牛睾丸，用胶原酶IV、透明质酸酶和DNase I组合酶法消化，细胞筛过滤，差异贴壁后取悬浮细胞；2)取悬浮细胞进行活细胞染色；3)流式细胞仪分选。有益效果：本技术方案为行之有效的水牛精子细胞分离方法，通过使用双酶法分解牛睾丸组织，得到单细胞悬液，采用连续差异贴壁法去除体细胞的干扰，再采用流式细胞仪根据未贴壁细胞染色后的荧光强弱，判断细胞DNA含量，有效消化和去除了二倍体精原细胞和四倍体初级经母细胞等其他非目标细胞的干扰，实现大量单倍体精子细胞的成功分选。

技术领域

本发明属于精子细胞处理技术领域，具体涉及一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法。

背景技术

精子细胞是一种单倍体细胞，属于睾丸生精细胞类型之一，在第二次减数分裂末期完成时产生。它是精子发生、成熟、形成功能性精子过程中第二次成熟分裂的结果，经过变形后形成精子。近年来，精子细胞显微注射授精技术已经成为辅助生殖的重要技术，高活率高纯度的精子细胞的获得在以后生殖医学的研究具有更广阔的前景。

目前常用的分离精子细胞的方法有密度梯度离心法和重力沉降法，但其步骤繁琐，对操作者经验要求较高，且分离得到的细胞纯度较低，分离的时间较长，细胞长时间处于非培养条件下，容易受到损伤。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供的一种操作简单、细胞纯度高的水牛精子细胞分离及相应的细胞鉴定方法。

具体技术方案是：一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其主要包括以下步骤：

1)获得水牛睾丸，用胶原酶IV、透明质酸酶和DNase I组合酶法消化，细胞筛过滤，差异贴壁后取悬浮细胞；

2)取悬浮细胞进行活细胞染色；

3)采用流式细胞仪根据细胞形态和染色情况进行分选，获得水牛精子细胞；

4)对获得水牛精子细胞进行鉴定。

优选的，水牛睾丸分离精子细胞及鉴定方法中步骤1)具体操作方法如下：

1)向装有组织的容器中加10倍体积的胶原酶IV溶液，37℃恒温摇床孵育15min；

2)加入适量透明质酸酶和DNase I，37℃恒温摇床孵育15min；

3)移液枪吹打组织至完全散开，无明显的组织块，离心弃上清，如此再重复2次；加入适量trypsin/EDTA、DNase I，37℃消化15min；

4)加入同体积含血清培养基终止消化，离心后重悬细胞，依次用200目细胞筛和300目细胞筛过滤；将细胞悬液转移到明胶覆盖的培养皿中，差异贴壁培养，收集悬液备用。

优选的，水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法步骤1)涉及试剂浓度如下：

所述collagenase IV浓度为2.5mg/ml，透明质酸酶浓度为10mg/ml，所述胰酶浓度为2.5mg/ml，DNase I浓度为5mg/ml，含血清培养基为含10％FBS的DMEM/F12培养基，明胶浓度为1mg/ml。

优选的，水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法步骤1)中细胞连续差异贴壁培养条件为：37℃，CO₂浓度为5.5％的培养箱中培养4至6小时，收集上层悬浮细胞，重悬培养4至6小时，重复三次。

优选的，水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法步骤2)具体操作如下，采取的细胞染色液为Hoechst 33342，浓度5μg/ml；孵育条件为37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育60min，用40μm过滤筛过滤，置冰上送流式分选。