[发明专利]一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法

权利要求书

1.一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

1)获得水牛睾丸，用胶原酶IV、透明质酸酶和DNase I消化，细胞筛过滤，差异贴壁后收集悬浮细胞；

2)取悬浮细胞进行活细胞染色；

3)采用流式细胞仪根据细胞形态和染色情况进行分选，获得水牛精子细胞；

4)对获得水牛精子细胞进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其特征在于步骤1)的具体方法如下：

1)向装有水牛睾丸组织的容器中加10倍体积的胶原酶IV溶液，37℃恒温摇床孵育15min；

2)加入适量透明质酸酶和DNase I，37℃恒温摇床孵育15min；

3)移液枪吹打组织至完全散开，无明显的组织块，离心弃上清，如此再重复2次；加入胰酶/EDTA、DNase I，37℃消化15min；

4)加入同体积含血清培养基终止消化，离心后重悬细胞，依次用200目细胞筛和300目细胞筛过滤；将细胞悬液转移到明胶覆盖的培养皿中，差异贴壁培养，收集悬液备用。

3.根据权利要求2所述的水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其特征在于涉及溶液浓度如下：

所述胶原酶IV浓度为2.5mg/ml，透明质酸酶浓度为10mg/ml，所述胰酶浓度为2.5mg/ml，DNase I浓度为5mg/ml，含血清培养基为含10％FBS的DMEM/F12培养基，明胶浓度为1mg/ml。

4.根据权利要求2所述的水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其特征在于步骤4)中细胞连续差异贴壁培养条件为：37℃，CO₂浓度为5.5％的培养箱中培养4至6小时，收集上层悬浮细胞，重悬培养4至6小时，重复三次。

5.根据权利要求1所述的水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其特征在于步骤2)中采用细胞染色液为Hoechst 33342，浓度5μg/ml；孵育条件为37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育60min，用40μm过滤筛过滤，置冰上送流式分选。

6.根据权利要求1所述的水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其特征在于步骤3)中流式细胞仪选用70μm喷嘴，鞘液压力70psi；根据DNA含量设门分选；分选中的前向散射光电压为150V，侧向散射光电压为245V，Hoechst-blue通道的电压为230V；保持进样速率约为10000个/s，接收管中预先加入200μl培养液。

7.根据权利要求6所述的水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其特征在于所述DNA含量设门为：以二倍体体细胞为参照，划定单倍体细胞群进行设门。