[发明专利]一种人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性检测试剂盒及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类静脉血栓风险基因F5和PAI‑1多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒包括用于扩增与人类静脉血栓风险相关的基因F5和PAI‑1多态性的检测试剂、阳性对照品及阴性对照品组成，所述用于F5基因多态性的检测试剂包含用于扩增F5基因rs6025位点的引物序列、PNA序列和PCR反应液，所述用于PAI‑1基因多态性的检测试剂包括用于扩增PAI‑1基因rs1799762位点的引物序列、PNA序列和PCR反应液。本发明所述试剂盒具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，且能在1小时内完成检测，并且结果判读简单客观。

技术领域

本发明属于生物医学临床检测技术领域，具体涉及一种人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

血栓的形成是机体对血管壁损伤产生的正常保护性反应，当促凝刺激超过机体抑制血栓形成的自然保护能力时，血栓过度生长、超出生理范围而对机体造成伤害。静脉中形成血块(血栓)即为静脉血栓，形成静脉血栓的危险因素主要分为两类：一类是获得性危险因素；另一类是遗传性危险因素，例如抗蛋白S缺乏(Ⅰ型)、凝血因子ⅤLeiden(FVL)、异常纤维蛋白原血症及其他凝血相关病症。其中，FVL是VTE形成的最为普遍的遗传性危险因素，有FVL的人群常以反复发生动静脉血栓为主要临床表现。血浆高浓度PAI-1(组织纤溶酶原激活物的主要抑制剂)的风险也逐渐被人们认知，4G等位基因风险指数较5G显著提升。

凝血因子Ⅴ(F5)基因位于1号染色体(1q23)，基因跨越70Kb，由25个外显子组成。凝血因子Ⅴ是凝血过程中重要的辅因子，它使凝血因子Xa激活凝血酶原，形成凝血酶。凝血酶切割纤维蛋白原形成纤维蛋白，纤维蛋白聚合形成构成血凝块的密集网状物。活化蛋白C(APC)是天然抗凝血剂，通过切割和降解凝血因子Ⅴ从而降低凝血的程度。F5第1691位核苷酸发生G→A的点突变(FVa)，使氨基酸序列上Arg506→Gln，导致APC无法灭活FVa，产生活化蛋白C抵抗现象(APCR)。突变后的FVa仍然保持促凝活性，凝血酶形成速度加快，导致高凝状态的形成。F5基因该SNP位点为rs6025(G>A)，也可以称为G1691A或1691(G>A)，基因型有AA、GA、GG。在2004年对丹麦人群中超过9,000位白种人成年人的研究中，AG和AA基因型分别比GG个体患静脉血栓栓塞的风险高2.7倍和18倍。血栓前状态的诊断对于血栓性疾病的预防治疗很重要，rs6025作为血栓高风险SNP对于预防诊断具有重要意义。

PAI-1蛋白是血浆中组织纤溶酶原激活物的主要抑制剂，基因定位于7号染色体长臂7q21.3-22，长约12.2kb，正常血浆浓度的PAI-1通过抑制组织纤溶酶原激活物控制血浆纤维蛋白水解酶的水解作用来调节血液的凝血稳态。转录起始上游-675bp处存在的1个G插入或缺失多态性rs1799762，即PAI-1 4G/5G插入或缺失多态性，表现为3种基因型4G/4G,5G/5G和4G/5G。研究证明转录起始因子位点4G、5G等位基因均存在于不同人群中，5G基因与抑制蛋白结合后，覆盖了阻遏蛋白与其相结合的位点，空间结构的改变后干扰了PAI-1转录水平，而4G等位基因没有转录抑制位点，导致4G基因转录水平较5G基因高6倍，从而影响PAI-1血浆水平升高，血小板聚集趋势增加，增加形成静脉血栓的风险。有文献表明4G/4G基因型者发生静脉血栓的风险是5G/5G型(正常纤溶型)的6.35倍，4G/5G基因型者发生静脉血栓的风险是5G5G型的4.85倍。同样，rs1799762作为血栓高风险SNP对于预防诊断具有重要意义。