[发明专利]人子宫内膜组织来源内皮祖细胞的分离培养方法

权利要求书

1.人子宫内膜组织来源内皮祖细胞的分离培养方法，是通过酶解法消化人体子宫内膜组织获得单细胞悬液，采用密度梯度离心法分离得到包含有内皮祖细胞的细胞群，接种于内皮祖细胞培养基中，进行培养及传代纯化，获得所述内皮祖细胞，其中所述酶解法使用胶原酶Ⅲ和DNase I，其特征是

所使用的人子宫内膜组织是以PBS清洗干净，并充分切碎的组织；

所述方法按照下述步骤进行：

1）以含250～350µg/ml胶原酶Ⅲ和30～50µg/ml DNase I的PBS缓冲液为消化液，将所述消化液与人子宫内膜组织按照2～4∶1的体积比混合，37℃水浴震荡消化40～60min后，抽取消化产物上清液，以1∶1的体积比加入10vol% FBS-DMEM/F12进行中和，终止消化后获得单细胞悬液；

2）将所述单细胞悬液以200目细胞滤网过滤，1000～1200r/min离心获得细胞团块；

3）分别配制密度为1.048～1.052g/ml，1.058～1.062g/ml，1.070～1.084g/ml的三种含有Percoll和Ads的梯度密度缓冲液，分别记为A液、B液和C液，其中B液以0.01g/l酚红标识；

4）在加有A液的离心管中移入等体积的B液，轻轻插入离心管底部缓慢滴加在A液下方，形成两层液体分离的界面；

5）用与A液等体积的C液重悬步骤2）获得的细胞团块，得到细胞悬液，将所述细胞悬液插入离心管底部缓慢加入在B液下方，形成具有无色-红色-无色三层液体清晰分离界面的梯度密度缓冲液；

6）以1300～1700r/min离心，将细胞分散在梯度密度缓冲液的不同密度区域，吸取B液下方和C液上方区域的细胞悬液，放入预先加入15～30ml 10vol% FBS-DMEM/F12的离心管中，轻柔混匀；

7）1000～1300r/min离心获得细胞团块，加入10～20ml 10vol% FBS-DMEM/F12，轻柔混匀，1000～1300r/min离心并收集细胞团块；

8）以45～55mg/L人纤维连接蛋白作为包被液，使其覆盖培养皿底面，37℃细胞培养箱中静置0.5～1.5h，包被培养皿；

9）EGM-2培养基重悬步骤7）收集的细胞团块，接种于包被的培养皿中，37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养，经不少于1次的传代培养纯化，分离得到人子宫内膜组织来源内皮祖细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是

将所述人子宫内膜组织以所述消化液消化不少于2次，合并消化得到的细胞悬液。