[发明专利]一种检测稻曲病病菌的方法

说明书

本发明公开了一种检测稻曲病病菌的方法，涉及分子生物学领域。本发明通过RAPD引物转化SCAR标记，可快速鉴定稻曲病病原菌，特异性高，无须根据稻曲病病菌的基因组DNA序列设计筛选特异性引物，直接提取样本DNA序列后即可进行鉴定，有效提高稻曲病病菌的鉴定效率。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种检测稻曲病病菌的方法。

背景技术

稻曲病是世界性水稻真菌病害，自从Cooke于1878年首次在印度取样采得水稻稻曲病病原菌后，现在该病己广泛分布在全球水稻主产区，包括美洲、南亚各国等40多个国家。该病害在大丰收时发生严重，也被称为“丰收病”，在过去年间只在中晚稻田零星发生，一直没有被人们所重视，从而被作为次要病害防治。但是90年代以后，随着密穗型高产、直立型水稻品种以及杂交水稻的推广力度的加大，并且农田土壤肥力的增加，该病害的发生也越来越严重，甚至在某些水稻种植区域己经作为主要的病害来应对处理，稻曲病对水稻的产量和品质都造成严重的影响，稻曲病菌产生的毒素，对人和动植物都有极大的毒性，给农业生产带来重大的损失。

稻曲病菌的有性态为子囊菌亚门拟黑粉菌属稻麦角菌，无性态为半知菌亚门绿核菌属绿核菌。病菌可以产生无性态的厚垣孢子、有性态的子囊孢子以及薄壁分生孢子。发生稻曲病的稻穗上的稻曲球表面附着的厚垣孢子是田间最常见的孢子形态，厚垣孢子黄色或墨绿色，圆形或稍椭圆形，表面有许多统状突起，黑色的厚垣孢子胞内基质浓缩，不易萌发，除非打破休眠状态，而黄色的厚垣孢子胞内基质均匀，比较容易萌发。稻曲病菌有性阶段形成的菌核黑色，呈纺锤形或马蹄形，能萌发形成子座、子囊壳、子囊和子囊孢子。厚垣孢子和子囊孢子萌发可以产生分生孢子，接着分生孢子萌发形成次生分生孢子，迄今分生孢子被认为是病菌有效的侵染形态。

体外扩增DNA采用PCR及其相关技术具有简便、快速、灵敏等一些优点，在植物病原真菌检测当中被广泛的应用。但是由于植物病原真菌的复杂性和植物病害的多样性，使传统的PCR技术较难满足需要，采用传统的致病性检测技术，需要较长的时间才能鉴定出稻曲病菌，降低了对该菌的分子鉴定、侵染机制和生活史的研究效率，因此，对于稻曲病的研究迫切需要建立一种基于DNA分子标记技术快速鉴定水稻稻曲病菌株的有效方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：针对目前稻曲病病菌鉴定中出现的问题，提供一种基于DNA分子标记技术快速鉴定水稻稻曲病菌株的有效方法。

为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

一种检测稻曲病病菌的方法，包含以下操作步骤：

(1)将已知的稻曲病菌株活化培养后收集菌丝球，滤纸吸干菌丝外表水分，放入-20℃冰箱储存备用；

(2)菌丝冷冻干燥后采取CTAB法提取DNA，检测提取DNA的浓度和纯度，之后将检测的DNA样品放入-20℃冰箱保存备用；

(3)采用随机引物对供试菌株DNA进行PCR扩增，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，80V电泳45min后切胶回收DNA；

(4)将回收的稻曲病菌特异性随机引物扩增片段与pGEM-T载体连接后转入大肠杆菌DH-5α中；

(5)采用菌落PCR筛选阳性单克隆，单克隆摇菌培养后提取质粒，对插入片段测序；

(6)将测序后的序列输入NCBI核酸数据库作BLAST分析，与GeneBank中己有序列进行同源性对比，验证序列为稻曲病菌的特异性序列，采用Primer 5.0设计病菌分子检测的特异性SCAR引物；

(7)在稻曲病发生的田块，于水稻黄熟期，采集病穗的谷粒，70％乙醇浸泡1min，无菌条件下分别剥取病穗谷粒颖壳和健穗谷粒颖壳各1g，CTAB法提取DNA，将提取的DNA测定浓度并稀释后作为DNA模板；