[发明专利]一种农杆菌介导的高效光果甘草遗传转化方法

说明书

本发明属于甘草基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的高效光果甘草遗传转化方法包括如下步骤：(1)将含有目的DNA的质粒导入农杆菌得到重组农杆菌；(2)培养重组农杆菌用作转化侵染液；(3)用侵染液浸泡光果甘草外植体；(4)将外植体放置于分化培养基共培养；(5)将共培养后的外植体转移至筛选及分化培养基上培养，并去除农杆菌；(6)以卡那霉素作为筛选压力，得到丛生芽；(7)将丛生芽接种至诱导生根培养基，即得到光果甘草抗性再生苗，抗性苗经PCR鉴定为阳性转基因苗。本发明所提供的光果甘草的遗传转化方法，操作简单易行，转化效率高，从转化起始至分化成苗、生根可以在55天内完成。本发明方法在光果甘草基因育种工程、细胞工程、代谢工程等领域具有广泛应用。

技术领域

本发明涉及生物领域的遗传转化方法，特别涉及农杆菌介导的高效光果甘草遗传转化方法及其应用。

背景技术

光果甘草(LyciumruthenicumMurr.)是豆科甘草属的一种多年生草本植物，多生长于河岸阶地，沟边、田边、路旁以及较干旱的轻微盐渍化土壤。在欧洲、地中海区域、哈萨克斯坦、乌兹别克斯坦、吉尔吉斯斯坦、塔吉克斯坦、俄罗斯西伯利亚地区以及蒙古有较为广泛的分布，在中国仅分布于新疆。光果甘草是中药甘草的原植物之一，具有清热解毒、润肺止咳、消炎祛痰、平喘解痉、抗肿瘤、抗病毒和提高免疫力等诸多药理功效，被广泛应用于药品和保健品的生产。目前对于光果甘草的研究主要集中在药用成分、生理机制、代谢产物提取工艺及药理分析方面，还未见有关光果甘草遗传转化体系建立的报道。

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种简单、快速、高效地获得转基因光果甘草的方法。从根癌农杆菌侵染光果甘草至转基因光果甘草生根可以在55天内完成。

本发明提供的获得转基因光果甘草的方法，包括光果甘草外植体的培养、胚性愈伤组织的诱导，以根癌农杆菌为介导的转化，具有抗性的愈伤组织筛选和胚性愈伤组织分化出苗的筛选、转基因苗诱导生根及分子检测等。

发明内容

本发明的目的是提供建立光果甘草遗传转化体系的方法。

本发明所提供的光果甘草遗传转化建立的方法，包括如下步骤：

(1)将含有目的DNA的质粒导入农杆菌得到重组农杆菌；将所述重组农杆菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于28℃振荡培养24-36小时；

(2)取所述步骤(1)的菌液于含有卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600值为0.6-0.8，离心收集菌体；

(3)用MS液体培养基重悬所述步骤(2)收集的菌体，28℃继续震荡培养至菌液OD600 值为0.6,用作侵染液；

(4)用所述步骤(3)的侵染液震荡浸泡光果甘草下胚轴10-15分钟，得到侵染后的光果甘草下胚轴；

(5)将所述步骤(4)得到的侵染后的光果甘草外植体放置MS诱导分化培养基于25℃黑暗中共培养2-3天，得到共培养物；

(6)将所述步骤(5) 将共培养的甘草外植体接种于MS筛选培养基上培养4-5周，得到丛生芽；

(7)将所述步骤(6)得到的丛生芽在生根诱导培养基上诱导生根，即得到光果甘草的抗性再生苗。

所述步骤(1)中含有卡那霉素的LB液 体培养基中各成分的浓度为：卡那霉素50mg/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L。

所述步骤(2)中含有卡那霉素的LB 液体培养基中各成分的浓度为：卡那霉素50mg/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯 化钠10g/L。

所述步骤(3)中所述菌液的OD600 值为0.6。