[发明专利]一种农杆菌介导的高效光果甘草遗传转化方法在审
| 申请号： | 201810588292.3 | 申请日： | 2018-06-08 |
| 公开（公告）号： | CN108728483A | 公开（公告）日： | 2018-11-02 |
| 发明（设计）人： | 沈海涛;刘海亮;祝建波;毕权;何大俊 | 申请（专利权）人： | 石河子大学 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;A01H5/00;A01H6/54 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 832000 新疆维*** | 国省代码： | 新疆;65 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 光果甘草 遗传转化 外植体 分化培养基 农杆菌介导 重组农杆菌 丛生芽 农杆菌 染液 筛选 基因工程技术 阳性转基因 代谢工程 基因育种 卡那霉素 细胞工程 诱导生根 转化效率 培养基 抗性苗 再生苗 成苗 抗性 质粒 甘草 去除 转化 接种 浸泡 生根 分化 应用 | ||
1.一种农杆菌介导的高效光果甘草遗传转化方法，包括如下步骤：
(1)将含有目的DNA的质粒导入农杆菌得到重组农杆菌；将所述重组农杆菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于28℃振荡培养24-36小时；
(2)取所述步骤(1)的菌液于含有卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600值为0.6-0.8，离心收集菌体；
(3)用MS液体培养基重悬所述步骤(2)收集的菌体，28℃继续振荡培养至菌液OD600 值分别为0.6和0.7，用作侵染液；
(4)用所述步骤(3)的侵染液震荡浸泡光果甘草外植体（下胚轴）15-30分钟，得到侵染后的光果甘草下胚轴；
(5)将所述步骤(4)得到的侵染后的光果甘草外植体放置MS诱导分化培养基于25 ℃黑暗中共培养2-3天，得到共培养物；
(6)将所述步骤(5)得到的共培养的甘草外植体接种于MS筛选及分化培养基上培养4-5周，得到丛生芽；
(7)将所述步骤(6)得到的丛生芽在生根诱导培养基上诱导生根，即得到光果甘草的抗性再生苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)（2）中含有卡那霉素的LB液体培养基中各成分的浓度为：卡那霉素50mg/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L。
3.根据权利要求1中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中所述菌液的OD600值为0.6。
4.根据权利要求1中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述光果甘草外植体（下胚轴）放入MS液体培养基中，在摇床（28 ℃ 220 rpm）浸泡震荡处理，时间10-15分钟。
5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中所述共培养培养基为：MS基本培养基，附加6-BA 1.5 mg/L、IAA 0.3 mg/L、KT 0.2 mg/L和6.0g/L琼脂粉。
6.根据权利要求1中任一所述的方法，特征在于：所述步骤(6)中所述愈伤组织诱导、筛选培养基和分化培养基是同一培养基为：MS基本培养基，附加6-BA 1.5 mg/L、IAA 0.3 mg/L、KT 0.2 mg/L、200mg/L羧苄青霉素、50mg/L卡那霉素和6.0g/L琼脂粉，培养温度为25℃，光强1500lx，每日光照14h。
7.根据权利要求1中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(7)中所述生根培养基为：1/2MS基本培养基，附加IAA 0.2 mg/L、200mg/L羧苄青霉素+50mg/L卡那霉素和6.0g/L琼脂粉，培养温度为25℃，光强1500lx，每日光照14h。
8.权利要求1中任一所述的光果甘草遗传转化体系建立的方法在获得光果甘草转基因材料中的应用。
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