[发明专利]一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法

说明书

一种真菌生物被膜流动模型的制备方法，包括真菌生物被膜流动模型装置构建、真菌菌种培养、真菌生物被膜孵育、真菌生物被膜评价、扫描电子显微镜检测。本发明的念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法，具有操作简易，稳定性和重现性良好的优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法。

背景技术

真菌生物被膜是指真菌附着于宿主腔道或生物材料表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等，将自身包绕其中而形成的膜样多细胞复合体。许多研究发现，各种真菌耐药程度与生物被膜形成过程有关，生物被膜越成熟，真菌的耐药性越强。

真菌在细胞体内、体外都可能形成生物被膜。体外生物被膜的形成方式主要有“静态、动态”两种，其中动态下形成的生物被膜由于形成的胞外基质更为丰富，结构更为复杂，从而使得被膜真菌有着更强的耐药性。

体外生物被膜模型包括静止和流动两种。生物被膜流动模型指真菌等微生物在流动状态下形成的生物被膜。目前常用的生物被膜流动模型大多操作比较复杂，通量相对较小，且很少用于混合生物被膜的孵育。

发明内容

本发明目的在于提供一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法，包括一念珠菌属真菌生物被膜流动模型装置，该念珠菌属真菌生物被膜流动模型装置包括一个用于容纳真菌培养基的第一容器、一蠕动泵、一个分液进样器、四个用于生物被膜孵育的第二容器和一个容纳流出液的第三容器；所述分液进样器设有一个进液孔，在所述进液孔的下方设有四个出液孔；所述第二容器的顶部设有顶部孔，底部设有底部孔；所述四个用于生物被膜孵育的第二容器位于同一水平面上，所述分液进样器的进液孔通过管路与所述蠕动泵的出液口连通，所述蠕动泵的进液口通过管路与所述第一容器连通，所述分液进样器的出液孔分别通过管路与所述第二容器的底部孔连通，所述第二容器的顶部孔分别通过管路与所述第三容器连通；

所述制备方法包括下列步骤：

第一步：首先将念珠菌属真菌菌株接种于SDB培养基中进行孵育，然后离心收集菌细胞，接着用无菌PBS缓冲液清洗，收集的菌细胞重悬于RPMI-1640培养基中，再孵育12~18小时后得到真菌培养液；

第二步：对所述真菌培养液进行离心分离，收集下沉的真菌细胞，添加真菌培养基至真菌细胞浓度为4-6×10⁶CFU/ml，得到重悬菌液；

第三步：将四个医用导管片放置到所述重悬菌液中，摇床孵育使菌体黏附到所述医用导管片上，然后取出所述医用导管片，用pH值为7.2的无菌磷酸缓冲液清洗除去黏附不牢的真菌细胞，接着将所述医用导管片分别放置到所述第二容器内，所述第二容器内容纳有真菌培养基，静置培养1.5~2.5小时后打开所述蠕动泵，流动孵育19~20小时；

第四步：将第三步得到的医用导管片先用pH值为7.2的无菌磷酸缓冲液清洗，然后放入容纳有pH值为7.2的无菌磷酸缓冲液的试管中，接着采用超声波处理至所述医用导管片上不含真菌细胞，收集得到含菌溶液；

第五步：将所述含菌溶液用pH值为7.2的无菌磷酸缓冲液稀释得到稀释液，然后将稀释液与XTT-维生素K3溶液混合于微孔板中，孵育后的菌液在492nm波长下检测其OD值。