[发明专利]基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法

说明书

一种基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法，在第一定点捕捉芯片中的捕捉位点周围，以放射状点阵形式修饰不同蛋白质的特异性识别抗体；向微管路注入待检测细胞溶液，使其在单细胞捕捉位点处产生不同的SPR响应信号；筛选出3‑6种SPR响应信号强的待测细胞的分泌蛋白标志物；在第二定点捕捉芯片中的单细胞捕捉位点周围，以扇形结构修饰不同抗体，向微管路注入待检测细胞溶液；在第二定点捕捉芯片中的扇形结构的两侧分别修饰条码形不同蛋白质的特异性识别抗体；向微管路注入细胞裂解液，对比不同条码处的SPR响应信号的强弱，实现高灵敏度监测。本发明能够实现多种分泌蛋白质的原位、动态监测，提高蛋白质分子的吸附固定量及其检测灵敏度。

技术领域

本发明涉及一种单细胞蛋白质组学监测方法。特别是涉及一种基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法。

背景技术

蛋白质组不仅能为生命活动规律提供物质基础，其研究也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，也可以为疾病的早期诊断提供分子标志。细胞异质性是基础医学和疾病研究中广受关注的特性。通过单细胞测量有助于深入了解该特性，并建立细胞功能/表型及细胞外微环境差异与细胞内状态变化之间的关系，为此单细胞蛋白质组学检测具有重要意义。

大多数单细胞蛋白质的检测(未改性的内源性目标)是免疫测定，包括酶联免疫吸附测定(直接法或者三明治法)、免疫细胞化学方法以及采用空间条码或者质谱流式细胞技术实现多种蛋白质复合检测的新免疫测定形式。其中流式细胞仪和酶联免疫斑点检测技术等传统方法是单细胞分析的金标准。另一种细胞蛋白质组学检测方法是质谱测定法，它能够检测大多数蛋白质的同源异构体。

然而流式细胞仪和酶联免疫斑点检测技术等传统方法通常包括复杂的功能化、固定化、孵育和洗脱步骤，需要较长的检测时间。所以，他们仅限于静态测量，不能满足在单细胞分析中增加动态信息的需求。质谱测定法的测量灵敏度无法满足单细胞关键信号蛋白的检测需求。目前细胞蛋白质分析主要集中在表面蛋白质和分泌蛋白质，并且现有测量方法大多只能实现表面蛋白质/细胞内蛋白质/分泌蛋白质中一类蛋白质的检测，缺少复用性能够实现多种靶蛋白(包括细胞内信号转导通路)检测的技术。另外，因为受到检测灵敏度的限制和定量检测前复杂的细胞/蛋白质捕捉、释放、转移流程的影响，现有测量方法大多不适合单细胞检测。

表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)现象对金属表面一定穿透深度内的电解质折射率的变化具有非常高的灵敏度。SPR传感器按照测量原理可以分为两大类：SPR光谱技术和SPR成像技术(SPR imaging,SPRi)。与SPR光谱技术相比，SPRi技术更适合对活细胞进行测试分析，因为该技术通过获得生物芯片表面的图像，既可以测量细胞的SPR信号，还可以监测细胞的位置或者形态。采用SPRi技术实时监测细胞内、外活动的过程中能够保持细胞的完整性。

测量局部折射率分布情况的SPRi技术特别适合于单细胞监测。通过在SPRi传感器的金膜表面修饰抗体阵列，能够进行蛋白质浓度、蛋白质之间相互作用等监测。但是，通过现有的点样仪、电聚合系统等只能在SPRi传感器的金膜表面修饰直径在百微米量级的抗体位点，所以目前SPRi技术只能用于蛋白质溶液或者细胞群的分泌蛋白质/细胞内蛋白质的检测，无法实现单细胞的复用性多蛋白监测。SPRi技术采用显微镜物镜(一般称为SPRmicroscopy,SPRM)或者棱镜对光和表面等离子共振波进行耦合。SPRM技术采用高数值孔径的物镜能够使空间分辨率达到入射光的光学散射极限。SPRM技术与基于棱镜的SPRi技术相比的优势是空间分辨率高、可以获得无失真图像。同时，由于SPRM技术视场范围比较小(100×100μm²)，十分适合单细胞的观测分析。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够进行蛋白质的高灵敏度检测的基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法。