[发明专利]产L-乳酸重组基因工程菌的固定化及其应用

说明书

本发明涉及产L‑乳酸重组基因工程菌的固定化及其应用，将乳酸脱氢酶基因,整合进光滑球拟酵母菌基因,形成重组DNA基因；通过PCR扩增，并经修饰后插入大肠杆菌表达载体，构建合成L‑乳酸的工程菌；将硅酸钠、十六烷基三甲基溴化胺、氯化铵和三氯化铝在水相及超分子自组装条件下，制备孔径为25～45nm的超大比表面积的超分子自组装模板；将上述超分子自组装模板,采用物理吸附法固定上述重组基因工程菌，并在含葡萄糖限制性培养基中发酵制备L‑乳酸，产物表达量可达23.5g/L，葡萄糖转化率68.51%，重复利用30次，产物表达量和葡萄糖转化率为22.6g/L和65.87%。

技术领域：本发明属于微生物发酵技术，涉及产L-乳酸重组基因工程菌的固定化及其应用。

背景技术

L-乳酸是重要的有机合成中间体，可用于基础生物基原料、医药原料、农药、化妆品、多功能添加剂等行业，特别是近年发展起来的聚酯和可降解塑料等产业扩大了L-乳酸的用途。

L-乳酸的制备方法主要有（1）发酵法：以含有淀粉的原料蔗糖、甜菜糖或其糖蜜为原料。糖化接入乳酸菌株。pH控制在5-5.5，温度50℃左右发酵3-4d，用碳酸钙使生成的乳酸转化为乳酸钙。并经中和、过滤、浓缩、脱色和重结晶等获得L-乳酸，原料消耗定额:大米2080kg/t、硫酸(98%)530kg/t。（2）乙醛氢氰酸法：以乙醛为原料与氢氰酸反应生成乳腈，再经水解得到粗乳酸。粗乳酸与乙醇酯化生成乳酸酯，再经分解成乳酸。再经水解、酯化、精馏等过程获得产品，原料消耗定额:乙醛480kg/t、氢氰酸290kg/t、硫酸1040kg/t。（3）丙烯腈法：以丙烯腈为原料与硫酸反应生成粗乳酸，再与甲醇反应生成乳酸甲酯，经蒸馏得粗酯，将精酯加热分解得乳酸。再经酸化、酯化、精馏和重结晶等获得产品。原料消耗定额:丙烯腈780kg/t、硫酸(98%)1030kg/t。本发明是将乳杆菌属乳酸脱氢酶基因Idhl整合进光滑球拟酵母菌基因MTⅡa,形成重组DNA基因IdhⅡa。通过PCR克隆该重组基因，并经修饰后插入大肠杆菌表达载体pTE28aT7构建L-乳酸工程菌pTE28aT7-IdhⅡa；在异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，在含有葡萄糖的限制培养基中，经发酵合成L-乳酸；通过过滤发酵液、有机溶剂萃取结晶和组合溶剂重结晶获得产品L-乳酸。合成工艺路线简捷，既节能又环保，所获得的产品质量高和成本低，总质量收率达到68.49%以上。

随着固定化酶技术的发展，越来越多的研究者关注于固定化大肠杆菌酶。固定化大肠杆菌酶具有如下优势：相较于游离酶，固定化酶在催化反应过程中，其质粒更加稳定，目的基因产物活力较高，产物易于分离纯化。自1959年Hattori首次将大肠杆菌酶吸附在树脂上实现了大肠杆菌酶固定化以来，固定大肠杆菌活酶或称为固定化增殖大肠杆菌酶的研究工作相继展开。

超分子通常是指由两种或两种以上分子依靠分子间相互作用结合在一起，组成复杂的、有组织的聚集体，并保持一定的完整性使其具有明确的微观结构和宏观特性。人们可以根据超分子自组装原则，使用分子间的相互作用力作为工具，把具有特定的结构和功能的组分或建筑模块,按照一定的方式组装成新的超分子化合物。这些新的化合物不仅仅能表现出单个分子所不具备的特有性质，还能大大增加化合物的种类和数目。如果人们能够很好的控制超分子自组装过程，就可以按照预期目标更简单、更可靠的得到具有特定结构和功能的化合物。本发明，将硅酸钠、十六烷基三甲基溴化胺、氯化铵和三氯化铝在水相和超分子自组装条件下，制备的孔径为25～45nm的超大比表面积（不小于1000m²/g）的超分子自组装模板。将上述超分子自组装模板，采用物理吸附法用来固定上述重组基因工程菌，并用于在含葡萄糖限制性培养基中发酵制备L-乳酸。本发明的固定化菌株，产物表达量最高可达23.5g/L，葡萄糖转化率高于68.51%；重复利用性好，重复利用30次后，产物表达量仍可达22.6g/L，葡萄糖转化率高于65.87%，将对L-乳酸的微生物发酵制备具有积极的作用，应用前景广阔。

发明内容