[发明专利]三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法在审
| 申请号： | 201810367775.0 | 申请日： | 2018-04-23 |
| 公开（公告）号： | CN108559759A | 公开（公告）日： | 2018-09-21 |
| 发明（设计）人： | 宋震;崔甜甜;宾羽;晏建红;李中安;周常勇 | 申请（专利权）人： | 西南大学 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/70;C12N15/66 |
| 代理公司： | 重庆市前沿专利事务所(普通合伙) 50211 | 代理人： | 邹晓艳 |
| 地址： | 400715*** | 国省代码： | 重庆;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 侵染性克隆 穿梭载体 构建 酵母菌 全长cDNA克隆 核苷酸序列 醋酸锂法 特异片段 同源重组 质粒转化 植株 反转录 共转化 基因组 农杆菌 线性化 总RNA 柑桔 酶切 接种 克隆 感染 覆盖 | ||
1.一种三元穿梭载体pCY，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
2.一种构建CLBV侵染性克隆的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取感染CLBV植株的总RNA，反转录后以cDNA作为模板，采用两对特异引物pCY-CLBV1F、CLBV1R与CLBV2F、pCY-CLBV2R分别进行PCR扩增，得到覆盖CLBV基因组全长的两个特异片段CLBV1、CLBV2；所述引物pCY-CLBV1F、CLBV1R、CLBV2F、pCY-CLBV2R的序列分别如SEQ ID NO:3～6所示；
(2)采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切如SEQ ID NO:17所示的三元穿梭载体pCY，得到pCY线性化的载体；
(3)TAR克隆：采用醋酸锂转化法将CLBV1、CLBV2和线性化三元穿梭载体pCY共转化酵母菌YPH501，通过同源重组获得CLBV基因组全长cDNA克隆pCY-CLBV；
(4)侵染性克隆鉴定：将pCY-CLBV质粒通过电击转化农杆菌C58C1，接种柑桔或本生烟，鉴定获得CLBV侵染性克隆。
3.如权利要求2所述的构建CLBV侵染性克隆的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的三元穿梭载体pCY的构建方法为：
A、采用限制性内切酶SacII单酶切双元载体质粒DK1317-2，得到线性化的载体；
B、以GenepYES1LVector为模板，以SEQ ID NO:1～2所示PYES2117F、PYES2117R为引物进行PCR扩增，然后回收目的片段；
C、将线性化DK1317-2载体和步骤B得到的回收片段进行重组融合，转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，即得。
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