[发明专利]一种海带抑藻活性物质的分离纯化方法与用途

权利要求书

1.一种海带抑藻活性物质的分离纯化方法，其特征在于，其步骤如下：

（1）称取海带干粉末4000 g，加入12 L无水甲醇，室温浸提12h后，浸提液倒出；再次加入新鲜无水甲醇，在上述相同条件下浸提；重复2次后，合并浸提液；经过滤和减压蒸干，制备到海带浸膏143.1 g；

（2 ）向此浸膏中加入520 mL90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，获得上清液500 mL；取此上清液1 mL，60℃下减压蒸干后，溶解于20 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测；在96孔板上，将1 μL待测组份溶液加入到199 μL藻液中，对照组为199 μL 藻液中加入1 μL无水甲醇；96孔板放置于光照培养箱内培养，温度20℃，光照强度2000 lx； 4d后，显微镜下计数藻细胞数量；其余上清液，加入乙酸乙酯萃取3次，每次分别为250mL、125mL和125 mL；乙酸乙酯层合并收集后，40 ℃下减压蒸干，获得7.45 g组份A；下层40℃下减压蒸发除去 乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次，每次分别为250mL、125mL和125 mL，上层和下层均在60℃下减压蒸干，分别获得7.24 g组份B和29.30 g组份C；分别称取10 mg上述3种组份，分别溶解于1 mL无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液，进行抑藻活性检测；

（3）将组份B和组份C分别溶解于8 mL和30 mL甲醇中，进行硅胶柱层析分离；组份B加载于200-300目、2.0×60 cm的硅胶柱上，以1:5氯仿/甲醇为洗脱液，流速 1.0 mL/min，每个馏分10 mL；组份C采用200-300目、5.0×100 cm硅胶柱层析进行分离， 1:5氯仿/甲醇为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分20mL；洗脱2倍柱体积后，所得馏分 40℃下减压浓缩，进行硅胶GF254薄层层析检测，展开剂为1:10氯仿/甲醇；合并相同馏分后，40℃下减压蒸干除去溶剂，依次获得再分组份B1和B2，以及再分组份C1、C2和C3；上述5个再分组份分别称取10mg，依次溶解于1mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测；

得对米氏凯伦藻的生长具有较为明显的抑藻活性的再分组份B1、B2和C2；将此3个再分组份分别溶解于3mL甲醇后，分别加载于2.0×60 cm Sephadax LH-20凝胶柱层析上，均以甲醇为洗脱液；洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，减压蒸干后，依次获得B11、B12和B13，B21，以及C21和C22 共6个组份；分别称取5 mg此6个组份，分别溶解于0.5mL甲醇中，进行抑藻活性检测；得到较为显著地抑制了米氏凯伦藻的生长的B13、B21和C21； B13和C21分别溶解于2 mL甲醇中，进行薄层层析分离制备；采用划线法，将组份B13和C21加载于100×200 mm硅胶薄层层析预制板上，分别以1:2石油醚/乙酸乙酯和4:1氯仿/甲醇为展开剂；经展开，组份B13和C21分别在硅胶预制板上呈现2个清晰且相距较明显的条带；将相应条带分别刮下收集，采用丙酮浸泡，过滤和减压蒸干后，制备到0.51 g B131和0.48 g B132，以及0.016 g C211和0.020 g C212；分别称取2 mg此4个组份，分别溶解于0.2 mL甲醇后，进行抑藻活性检测；

（4）取适量上述5种抑藻活性组份 B131、B132、B21、C211和C212，溶解于甲醇后，点样于硅胶GF254上，分别在1:1氯仿/甲醇， 1:2环己烷/乙酸乙酯和1:1:0.5正丁醇/醋酸/水3种展开剂下展开，此5种组份均呈现单一斑点；采用10%硫酸溶液和碘2种显色剂下，此5 种组份同样呈现单一斑点。