[发明专利]一种固定化脂肪酶及其制备方法

说明书

本发明公开了一种固定化脂肪酶及其制备方法。本发明用1.0mol/L的pH为6.0的磷酸钾缓冲液溶解脂肪酶酶粉制备浓度为2.0mg/mL的酶液，10000r/min离心后得到澄清酶液，按照5.0g：4mL的比例将型号为LXEP‑120的环氧树脂置于酶液中，在150rpm、22℃条件下固定化12h，然后用1.0mol/L的pH为6.0的磷酸钾缓冲液溶洗涤3次，抽滤，于40℃干燥，得到固定化脂肪酶；其酶活约为400U/g，酶活回收率达到92.79％，具有良好的pH耐受性、温度耐受性、操作稳定性以及储存稳定性，符合工业应用的需要。

技术领域

本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种固定化脂肪酶及其制备方法。

背景技术

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)，是一类十分重要的生物催化剂，能分解底物产生各种天然油脂。作为一种生物催化剂，脂肪酶具有催化效率高、专一性强、副产物少、反应条件温和的特点，被广泛地应用到手性化合物的拆分、生物柴油的制备、食品加工和日用化工等行业。但是，由于游离酶本身存在的稳定性差、分离回收困难和难以实现反复连续利用等缺陷，很大程度上限制了其在工业生产中的实际应用。为了解决游离酶存在的以上缺点，真正将酶制剂应用到工业生产中去，人们开展了酶的固定化研究。

酶的固定化方法有多种，较为常用的有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。共价结合法固定化酶是把酶的非活性侧链基团和载体中的活性官能团共价键合，固定化得到的酶通常具有良好的稳定性，在连续使用的过程中酶活损失较小，是目前较为受青睐的一种固定化方法。利用共价键固定化的官能团载体有很多种，较为常用的有羧基类、氨基类和环氧基类。由于环氧基团具有很高的活性和可塑性，在常温下就可以与酶蛋白表面的氨基酸残基(-NH₂、-COOH、-HS等)发生温和的开环共价结合，从而将酶分子固定在载体表面。并且，由于一些合成的树脂载体在较长的生产周期内具有很强的耐微生物、耐碱腐蚀作用和较强的机械性能，所以利用含有环氧基团的树脂来固定化酶，在通常情况下可以得到稳定性较好、机械性能较强的固定化酶，能够较好地适应复杂的工业操作环境。

目前，用于工业酶固定化的环氧树脂主要是Eupergit C等国外公司生产的环氧树脂，但是国外进口的环氧树脂价格较为昂贵，从国外进口需要花费大量的外汇资源。因此，开发基于国产环氧树脂进行工业酶的固定化方法，以减少对国外公司生产的昂贵的环氧树脂的依赖，很有必要。而目前基于环氧树脂载体的固定化脂肪酶的报道较少。

发明内容

本发明的目的是为了减少对国外公司生产的昂贵的环氧树脂的依赖，利用国产的环氧树脂替代进口的环氧树脂，通过优化固定化过程，得到性能更为优异的环氧树脂固定化脂肪酶，提供一种经济实用的固定化脂肪酶及其制备方法。

本发明通过对国产的环氧树脂进行筛选，使用国产环氧树脂LXEP-120固定化脂肪酶，研究了影响固定化效果的多个重要参数，确定了最佳的固定化工艺，并分析了制备的环氧树脂固定化脂肪酶的酶学性质以及稳定性。

本发明的第一个目的是提供一种固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：

将脂肪酶溶于pH 5.5～8.5的缓冲液中，10000r/min离心得到脂肪酶酶液，按照环氧树脂：脂肪酶酶液为0.5～7g：4mL的比例将环氧树脂放入酶液中，在18～28℃条件下固定化12～24h；然后洗涤、抽滤、干燥。

优选，所述的环氧树脂为环氧树脂LXEP-120、LX-1000EP、ES-1、ES-3、ES-5或ES-7。

更优选的，所述的环氧树脂为环氧树脂LXEP-120。

优选，所述的缓冲液为磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

优选，所述的缓冲液为浓度为1.0mol/L的pH 6.0的磷酸钾缓冲液。