[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9编辑陆川猪CD163基因的方法在审
| 申请号： | 201810361154.1 | 申请日： | 2018-04-20 |
| 公开（公告）号： | CN108823248A | 公开（公告）日： | 2018-11-16 |
| 发明（设计）人： | 何祖勇;陈瑶生;刘小红;王敏;刘小凤 | 申请（专利权）人： | 中山大学 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N15/85;A01K67/027 |
| 代理公司： | 广州新诺专利商标事务所有限公司 44100 | 代理人： | 刘婉 |
| 地址： | 510275 *** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因 结构域 外显子 荧光筛选 猪基因组 有效地 构建 删除 | ||
1.一种利用CRISPR/Cas9编辑陆川猪CD163基因的方法，其特征在于：在陆川猪基因组的CD163基因的外显子7上设计两条gRNA，分别构建至pX458和pX458R载体上，使CD163基因实现DNA片段的精确删除而破坏外显子7所编码的SRCR5结构域，得到抗PRRSV感染的CD163基因编辑猪；其中，所述CD163基因的外显子7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用于打靶所述CD163基因的外显子7的所述两条gRNA分别为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子以及核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的单链DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：通过CRISPR/Cas9进行基因编辑对应的精确删除区域为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列自5’末端第24-147位的核苷酸。
4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9进行基因编辑的步骤如下：
步骤1：将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的gRNA-10构建到能表达Cas9蛋白和报告基因EGFP的pX458载体上，得到Px458-gRNA-10；将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的gRNA-134构建到能表达Cas9蛋白和报告基因DsRed的pX458R载体上，得到Px458R-gRNA-134；将所述pX458-gRNA-10和所述pX458R-gRNA-134共转染猪的离体胎儿肾细胞，得到CD163基因编辑细胞群；
步骤2：用于扩增CD163基因外显子7编辑区域的引物对对所述CD163基因编辑细胞群进行PCR扩增，通过T-A克隆方法检测PCR扩增产物，计算克隆中含有编辑型CD163基因的克隆比例，即为该CRISPR/Cas9系统编辑效率。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述用于扩增CD163基因外显子7编辑区域的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子以及核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示的单链DNA分子。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述编辑型CD163基因为野生型CD163基因外显子7中123bp DNA片段缺失使SRCR5结构域被破坏所得到的基因型。
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