[发明专利]一种玉米遗传转化方法

说明书

本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种玉米遗传转化方法，包括如下步骤：制备转化受体、制备侵染液、侵染、共培养、恢复培养、筛选、分化培养，得到玉米的带有潮霉素抗性基因或Bar抗性基因的玉米遗传转化植株。本方法过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的玉米转基因植株。

技术领域

本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种玉米遗传转化方法。

背景技术

玉米是重要的粮食、经济、油料作物，同时也是重要的工业作物。随着社会经济的不断发展，人们对玉米的需求也日益增多。遗传转化技术的飞速发展为玉米品种的增多起到了重要的作用，但是目前玉米的遗传转化仍然存在着转化时间长、转化率低的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种玉米遗传转化方法，通过调整过程中的培养基及培养参数，大大缩短了玉米遗传转化的时间，并且提高了遗传转化率。

本发明是这样实现的，一种玉米遗传转化方法，包括如下步骤：

1)制备转化受体

灭菌：授粉7-13d的玉米棒子用70％的乙醇灭菌10min；

去胚乳：使用无菌水清洗幼胚2-5次，洗掉胚乳，获得幼胚的长度在2-4mm；

2)制备侵染液

取50ml Zm-inf，依次加入Cys 130μl、HCl 130μl、AS 100μl、Vc 25μl，将农杆菌挑至混合液中，制成侵染液；

3)侵染

将调好的侵染液加至放有玉米幼胚的瓶中，放置摇床100rpm侵染20min，之后取出置于无菌滤纸上吹20min；

4)共培养

将步骤3)吹至表面无液体的幼胚，接至放置有一张灭菌滤纸Zm-cocu共培养基上，幼胚盾片朝上，暗处培养3天，除去幼胚上长出的芽，保留淡黄色的幼胚；

5)恢复培养

将共培养后的幼胚取出放置于灭菌皿中，观察幼胚是否膨胀大，边缘是否有愈伤，之后将幼胚放入zm-reco培养基中恢复7d；

6)筛选

第一次筛选：选择出无污染、淡黄色的幼胚接入到第一次筛选培养基中筛选7d；

第二次筛选：第一次筛选后，将幼胚转入到第二次筛选培养基中筛选14d，筛选3-5次，直到筛选到胚性愈伤；

7)分化培养

将获得的胚性愈伤接入分化培养基Zm3中光培养，每12～15d循环继代一次，直到玉米新芽长出到3-4cm；

各步骤中用到的培养基具体配方见下表：

上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：

进一步地，所述步骤2)中制备的侵染液OD₆₀₀＝0.8。

进一步地，选用的农杆菌为EHA105。

进一步地，所述农杆菌携带的抗性基因为潮霉素抗性基因，所述第一次筛选培养基为zm Hn15，第二次筛选培养基为zm Hn30；

上述培养基配方为：

上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：