[发明专利]一种刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼鳃组织的免疫模型构建方法

说明书

本发明首次采用刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼单侧鳃的方式来进行免疫，采用最优化的感染浓度和感染时长，首次构建了刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼鳃组织的免疫模型，彻底消除了鱼类局部鳃组织黏膜免疫应答过程中“先天性差异”所带来的负面影响，为研究局部黏膜免疫应答规律提供了理想的免疫模型。本发明免疫模型的构建方法主要包括5个歩骤：(1)刺激隐核虫活幼虫的收集和浓度计算；(2)斜带石斑鱼的分组和驯养；(3)局部鳃组织免疫；(4)感染强度的测定；(5)局部感染后鱼体的处理。

技术领域

本发明属于鱼类免疫领域，具体为鱼类黏膜免疫方向，具体涉及一种诱导斜带石斑鱼鳃组织局部黏膜免疫的免疫模型的构建方法。

背景技术

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是一种原生纤毛虫，可感染几乎所有海水硬骨鱼类引起严重的致死性疾病——刺激隐核虫病或称白点病(Colorni A and BurgessP.，1997)。刺激隐核虫的生活史包括滋养体、包囊前体、包囊和幼虫等4个阶段，其中只有滋养体营专性寄生生活，以宿主体液、组织碎片以及完整细胞等为食。近年来，由于我国海水养殖的超负荷发展，养殖环境的恶化，刺激隐核虫病已经成为大范围、经常性爆发的烈性传染病，给海水渔业造成了非常严重的危害。2008年，农业部将刺激隐核虫病列入我国“二类动物疫病”名录，是我国“一、二类动物疫病”名录中唯一一种水产寄生虫病，可见其危害的严重性。

不同于病毒、细菌等其他微生物病原的全身感染，刺激隐核虫主要寄生于宿主的皮肤、鳍条和鳃上，其独特的寄生性质使其成为研究海水鱼类局部皮肤和鳃黏膜免疫应答的良好模型；此外，虽然刺激隐核虫不能在体外培养，但我们建立了以卵形鲳鲹为宿主的刺激隐核虫活体传代方法和低温保种方法，使我们可以随时获得大量的虫体进行人工定量感染实验，这是绝大多数水产寄生虫所做不到的(Dan et al.，2006；Dan et al.，2009)。

目前，关于刺激隐核虫感染诱导的宿主局部黏膜免疫应答的研究，主要是通过刺激隐核虫全身体表感染宿主鱼模型进行的(Yambot et al.，2006；Luo et al.，2007；但学明等，2008；Misumi，et al.，2011，2012)。此种方法感染后，鱼的皮肤、鳃和鳍条全部同时被感染，再通过比对感染组与非感染组不同个体鱼之间黏膜免疫应答的差异，揭示宿主抗刺激隐核虫感染的局部黏膜应答规律。然而，由于鱼类不同个体之间存在遗传差异，比较不同个体之间免疫应答的差异存在“先天性缺陷”。近期，有研究人员将石斑鱼泄殖孔以下部分浸入到刺激隐核虫的虫液中，进行局部尾部感染，再采集感染部位的皮肤和同一条鱼未感染的皮肤，进行转录组测序，比较同一尾鱼身上感染部位与非感染部位皮肤黏膜免疫应答的差异(Hu et al.，2017)。该方法排除了不同个体遗传背景的差异，相较于比较不同个体之间的差异已有很大改进。但该方法不能排除同一尾鱼尾部和尾部以外皮肤正常情况下免疫应答的差异。基于此，本发明建立了一种刺激隐核虫感染鱼体单侧鳃的模型，可供比较同一尾鱼左右两侧感染与未感染鳃局部免疫应答的差异，使结果更加精准。

发明内容

本发明旨在克服海水鱼在刺激隐核虫免疫后个体差异所产生的影响，通过在同一尾鱼的单侧鳃实施局部黏膜免疫，为研究局部黏膜免疫应答提供稳定、可靠的实验材料。

本发明采用独特的感染方式，培育出仅有单侧鳃局部组织完成免疫的海水鱼。

本发明的独特之处在于，首次采用局部感染单侧鳃的方式来进行免疫，采用最优化的感染浓度和感染时长，首次构建了刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼鳃的免疫模型，彻底消除了鱼类局部组织黏膜免疫应答过程中“先天性差异”所带来的负面影响，为研究局部黏膜免疫应答规律提供了理想的免疫模型。此外，还可以对同一鳃局部组织进行多次的免疫以生产出局部多次免疫鱼体，方便后续免疫记忆的研究。

本发明的优势在于，解决了在研究鱼类黏膜免疫过程中，鱼类个体差异或者组织差异产生的影响，并为研究鱼类局部黏膜免疫应答提供理想的实验材料和免疫模型。