[发明专利]透明质酸高通量微量快速检测方法

权利要求书

1.一种涉及到透明质酸(hyaluronic acid,HA)定量快速检测方法，特点在于本方法区别于传统行业标准的紫外分光光度计方法，本专利是关于建立一个使用酶标仪于530nm处进行吸光度(OD值)检测的高通量微量快速方法，步骤如下：

A.准备工作：

a.配制0.125％咔唑乙醇溶液和0.025M四硼酸钠硫酸溶液；

b.HA标准品准备

称取适量医用级HA，加入双蒸水稀释，配制成10mg/mL；

B.制备HA标准液系列(梯度稀释法)

制备HA浓度为0，0.078，0.156，0.312，0.625，1.25，2.50，5.00，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100，200，400，800，1600，3200，6400μg/mL系列标准液(注意：传统法《中华人民共和国医药行业标准YY0308-透明质酸钠含量测定》中标准液使用葡萄糖醛酸，其系列浓度为0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0μg/mL)。

C.微孔(96孔板)快速反应酶标仪检测，即高通量法的建立并和传统法比较

a.传统法对照：15mL试管反应产物/紫外分光光度计检测(传统法)

参照传统法《中华人民共和国医药行业标准YY0308-透明质酸钠含量测定》所述方法用试管进行实验，分别取1mL各标准液于各试管中，标记，置于冰水浴中，各管缓慢加5mL0.025M四硼酸钠硫酸溶液，摇匀，95℃水浴15min后冰水浴迅速冷却，各管加0.2mL0.125％咔唑乙醇溶液，摇匀后95℃水浴15min，冷却至室温。以浓度为0的试管作对照，用紫外分光光度计和比色皿(3mL)测定530nm处的吸光度，每测一个浓度都需要更换比色皿。

b.半传统法对照：15mL试管反应产物/酶标仪检测

分别取100μL上述在试管中反应的液体，置于微孔(96孔板)中，用酶标仪测定530nm处的吸光度。

c.微量高通量法(本专利)：微孔(96孔板)反应产物/酶标仪检测(高通量法)

96孔板，分别取20μL各系列浓度的标准液于微孔中，置于冰上；缓慢加100μL 0.025M四硼酸钠硫酸溶液于各孔中混匀；95℃水浴15min后置于冰上将反应物迅速冷却；各孔再加4μL 0.125％咔唑乙醇溶液混匀，95℃水浴15min后，冷却至室温。用酶标仪在530nm处测定吸光度，并以标准HA浓度(横坐标)对相应的吸光度(纵坐标)作标准曲线。检测样品则按标准曲线给出的公式计算样品HA浓度。

D.HA微量高通量法的灵敏度和重复性测试

重复9次以上HA系列标准浓度微量反应和吸光度的酶标仪检测，使用分析软件GraphPad Prism 7以标准液浓度对相应的OD值作图，并作数据处理，用平均值±标准偏差表示。计算本检测方法的灵敏度(最低检测限lower limit concentration,LLC)和重复性(变异系数the coefficient of variation,CV％)。CV值不大于10％，则检测方法视为可重复。

E.应用实例

使用本申请建立的方法，检测了类风湿大鼠模型中免疫前和免疫后大鼠滑膜液HA水平的变化，并发现该HA水平的变化与类风湿病变进程相关。另外，使用本申请建立的方法，检测了某品牌面膜中HA的含量。

2.本申请建立了一个HA高通量微量检测方法(微孔反应和酶标仪检测)，与传统方法对比，本方法标准曲线的结果(R²＝0.992)和传统法的结果平行，但最低检测限为30μg/mL,远低于传统法；本方法重复性好灵敏度，CV为2-7％；本方法特征在于所需样品量少(10-20μL，微孔中生化反应)、使用试剂少和检测时间短，并使用酶标仪一次性检测样本数量大(96孔板)远优于传统方法中使用的试管中生化反应(15mL)和紫外分光光度计与比色皿(3mL)单次检测。由于HA的普遍存在于自然产品、生物产品和工业产品中，所以本发明可以适用于化妆品、生物产品、生物材料、药品等中的HA含量测定，同时也可用于人、大鼠等研究对象的组织液以及实验细胞液中HA浓度的体外微量快速测定。