[发明专利]一种高通量的转基因元件筛选检测的方法

说明书

本发明提供了一种基于KASP(竞争性等位基因PCR)技术的高通量转基因元件筛选检测的方法，所述检测方法包括如下步骤：(1)设计转基因元件的引物及内源基因的引物；(2)提取样品的DNA；(3)利用上述转基因元件的引物、内源基因的引物、KASP反应液以及样品DNA，进行PCR反应，判断样品是否含有转基因元件。利用本方法对植物样品进行转基因元件筛选检测具有效率高、成本低、准确率高以及易于操作等优点。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的，涉及一种基于KASP（竞争性等位基因PCR）技术的高通量转基因元件筛选检测的方法。

背景技术

对转基因作物及其产品的分子检测是转基因生物安全管理的基础。目前我们国家只批准一部分转基因棉花、杨树、木瓜的种植。对农作物进行常态化的转基因元件筛选检测，有利于我们国家相关部门对转基因作物的种植进行有效的监管。

转基因元件的筛选检测主要是针对包括启动子、终止子、筛选标记基因等转基因元件的检测。目前常用的转基因作物的检测方法有基于样品DNA的检测方法以及基于样品蛋白质的检测方法，但这些方法均存在不足与缺陷。基于样品DNA有普通PCR和荧光定量PCR，前者需要电泳以及紫外观察的过程，操作繁琐，耗时长，难以实现高通量检测；后者的检测费用昂贵，特别是检测过程中需要使用基因特异性探针，成本很高。而且这两种方法的自动化程度不高，单位时间内能检测的样本数量有限，而且手工操作容易导致实验误差和实验污染。基于样品蛋白质的检测方法包括酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linkedimmuNOSorbent assay, ELISA）和基于双抗体夹心免疫层析原理的转基因快速检测试纸条，这两种方法的缺陷在于他们无法区分表达相似蛋白的转基因品系, 无法检测蛋白已经变性的样品，也无法检测不编码蛋白的转基因元件比如启动子或终止子，另外抗体的研发以及实验体系的建立比较复杂，造成前期的成本高。总之，依靠上述常规的方法，很难实现对作物进行高通量的转基因元件筛选检测。

因此，亟需开发一种高通量、低成本、简单快捷以及低错误率的转基因元件筛选检测方法。KASP（竞争性等位基因PCR）是一种基于荧光检测的基因分型技术。进行检测的时候，每个反应孔采用双色荧光（一般是FAM荧光和HEX荧光）检测一个样本的某一位点可能的两种基因型。该技术现阶段主要被应用于SNP基因分型研究中，成为分子辅助育种、性状基因的精细定位、以及种子资源鉴定的主要技术手段。

然而，目前尚未见利用KASP技术对作物进行高通量转基因元件筛选检测的报道。

发明内容

有鉴于此，提出本发明。

本申请要求2016年12月30日提交的中国专利申请CN201611260141.2 的优先权，其全部内容通过引用方式并入本文。

KASP技术被研究者广泛应用于SNP基因分型等的研究中，通过对一段含有SNP位点的基因序列设计不同引物来进行SNP分型，而并未见将KASP技术应用于转基因元件筛选检测的报道。本发明的发明人通过将两组引物分别设计为内源基因引物和转基因元件引物，来检测样品是否含有转基因成分，进而提高了转基因筛选检测的效率。

与KASP技术应用于SNP分型不同，将KASP应用于转基因元件检测时需要针对两个不同的基因进行引物的设计，如何保证两个基因的引物之间没有互相干扰成为本应用的一个难点。另外在进行大批量样品检测的时候，如何准确地转基因元件阳性样品和阴性样品也是本应用的一个难点。

本发明中，发明人经大量尝试，确定了主要农作物的内源基因和常用转基因元件引物的优良组合。通过该发明的方法, 不仅可以检测样品是否含有转基因元件，同时可以验证该反应是否正确进行（如果没有内源基因的检测信号，则证明此次反应没有正确进行），显著提高了对转基因元件的检测效率。

具体的，本发明的技术方案如下：